细胞因子及抗体检测技术.ppt

（七）结果判定操作方法：拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。结果判定：光密度（oplicaldensity，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。第31页,共44页，星期六，2024年，5月定性测定定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔第32页,共44页，星期六，2024年，5月2.定量测定ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。第33页,共44页，星期六，2024年，5月第34页,共44页，星期六，2024年，5月三、基本操作注意事项（一）加样:一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。方法：加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。第35页,共44页，星期六，2024年，5月（二）孵育ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的孵育温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。第36页,共44页，星期六，2024年，5月（三）洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。洗涤目的：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。第37页,共44页，星期六，2024年，5月第38页,共44页，星期六，2024年，5月第39页,共44页，星期六，2024年，5月四、实验中常出现的问题1.ELISA出现“一片黄”的原因：酶结合物浓度过高底物不新鲜洗涤不干净2.ELISA出现“一片白”的原因：载体吸附性能差底物错稀释液作包被液加错试剂包被时间过短酶活力低或下降样品含有NaN3第40页,共44页，星期六，2024年，5月间接ELISA法操作步骤

1.样本的收集；2.包被抗原；3.封闭；4.加稀释的待检样品；5.加酶标抗抗体；6.加底物显色；7.终止反应第41页,共44页，星期六，2024年，5月实验报告内容：实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验结果、讨论与分析要求：只接受纸质、手写体报告。递交时间：2011年11月12日，张晓老师。第42页,共44页，星期六，2024年，5月样本收集包被抗原封闭加入待检样品，10min洗涤3次加入酶标二抗，10min洗涤3次洗涤3次加入显色液3、4液各一滴洗涤8次已完成未完成第43页,共44页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第44页,共44页，星期六，2024年，5月关于细胞因子及抗体检测技术背景知识研究细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和指导临床治疗均具有重要意义抗体具有高特异性、高亲和力等特点，目前已广泛应用于免疫学、微生物学、肿瘤学、遗传学以及分子生物学等各个领域第2页,共44页，星期六，2024年，5月细胞因子的检测方法：1)生物学方法①依赖性细胞株：生物分析法②功能检测：生物分析法2)分子生物学方法①分子杂交技术：m