细胞工程培养细胞的生长增殖过程.ppt

刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层：第31页,共57页，星期六，2024年，5月

细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：

第32页,共57页，星期六，2024年，5月细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：

第33页,共57页，星期六，2024年，5月检查细胞形态及活力：状态良好的细胞应是轮廓不十分清晰，而生长不良的细胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则。第34页,共57页，星期六，2024年，5月检查营养液PH及污染：新鲜的呈桃红色，PH在7.2-7.4之间。培养一段时间后，PH下降，培养液变黄。ＣＯ２培养箱可自动控制5%ＣＯ２的含量。第35页,共57页，星期六，2024年，5月细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数第36页,共57页，星期六，2024年，5月第37页,共57页，星期六，2024年，5月程序

用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液.取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。镜下观察计数：计算计数板四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内。

按下式计算：细胞数/毫升原液=注意：镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上,说明消化不充分；细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米

时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液,再计算。第38页,共57页，星期六，2024年，5月细胞计数：细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数量。一般以细胞数/毫升表示。用品：细胞悬液,培养液,计数板。第39页,共57页，星期六，2024年，5月1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

计数法:

第40页,共57页，星期六，2024年，5月寻根问底胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。第41页,共57页，星期六，2024年，5月贴壁生长细胞传代小结加消化液得到分散的单细胞倒掉消化液

加培养液终止消化吹打成细胞悬液接种2-4个培养瓶生长第42页,共57页，星期六，2024年，5月贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体表面才能正常生长，最终在附着表面扩展成单层。第43页,共57页，星期六，2024年，5月贴壁培养的材料与系统贴壁培养的表面要求具有净阳电荷和高度的表面活性。如果是有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。主要材料有：玻璃、塑料、金属、微载体。第44页,共57页，星期六，2024年，5月贴壁培养的系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。转瓶培养系统的核心是采用可以摇动或转动的圆筒培养容器，能使细胞交替接触培养液和空气。但是，该系统具有表面积有限、培养条件检测受到限制、劳动强度大、占用空间大等不足。第45页,共57页，星期六，2024年，5月凡·维茨尔开发的微载体培养系统一定程度上克服了这些缺陷。微载体培养动物细胞是一种适合大规模生产动物细胞生物制品的一种非常有价值的培养技术第46页,共57页，星期六，2024年，5月贴壁生长的细胞生长特性原本为圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就可铺满生长表面，形成致密的细胞单层。这种方法易于观察细胞生长状况，适宜于实验室研究。但是如需继续培养，需将单层细胞再分散，稀释后再