细胞信号转导研究方法.ppt

2、受体的改变促细胞增殖因子受体的表达增多或异常激恬．

???(1)某些生长因子受体表达异常增多：如前列腺癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤、卵巢癌中发现有编码表皮生长因子受体(EGFR)的原癌基因erbB的扩增及EGFR的过度表达；神经胶质细胞瘤中神经生长因子受体(NGFR)明显增多；人多发性骨髓熘细胞及成人T细胞白血病细胞膜上的IL一2受体及IL6受体表达异常增高。

???脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等有血管内皮细胞生长因子(VEGF）受体、FGF受体以及PDGF受体的高表达。第63页,共71页，星期六，2024年，5月(2)突变使受体组成型激活：如肺癌、乳腺癌、卵巢癌中发现一种缺失N端配体结合区的头部截短的EGFR．这种受体处于配体非依赖性的持续激活状态．能持续刺激细胞的增殖和转化。第64页,共71页，星期六，2024年，5月3、细胞内信号转导蛋白的改变在人类肿瘤中发生频率最高的突变是小G蛋白Ras的激活型突变。最常发现的Ras突变是第12位甘氨酸、13位甘氨酸或61位谷氨酰胺为其他氨基酸残基所取代。导致Ras自身GTP酶活性下降。第65页,共71页，星期六，2024年，5月（二)抑制细胞增殖的信号转导过弱转化生长因子β对多种肿瘤细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用，TGFβ受体是具有丝／苏氪酸蛋白激酶活性的受体，受体与配体结合后．能磷酸化下游的smad蛋白家族，后者以二聚体的形式转入核内，通过抑制细胞周期依赖性激酶4(cDK4)的表达，诱导cDK抑制因子的产生，将细胞阻滞于GI期。如胃肠癌、肝癌有受体的突变．多种肿增有smad4的失活、突变或缺失。第66页,共71页，星期六，2024年，5月三、心肌肥厚心肌肥厚发生的信号转导通路

???化学信号(激素、生长因子等)，机械信号，导致基因表达的改变．诱导心肌细胞RNA和蛋白质的合成，并最终导致心肌肥大和心室重构的发生。第67页,共71页，星期六，2024年，5月1、激活PLc—PKc通路去甲肾上腺素、血管紧张素Ⅱ以及在心血管疾病中体内增多的神经体液因子和生长因子／细胞因子等可以激活磷脂酶c(PLc)，产生脂质双信使DAG和IP3。DAG可激活蛋白激酶c(PKc)。此外．牵拉刺激也激活PKC。2、激活cAMP—PKA通路去甲肾上腺素等配体与G蛋白耦联受体结合后．可以通过刺激G蛋白(Gs)，激活腺苷酸环化酶(Ac)，并引发cAMP—PKA通路。第68页,共71页，星期六，2024年，5月?3、激活MAPK家族的信号通路生长因子、肾上腺素和血管紧张素等化学信号以及牵拉刺激等力学信号还能激活MAPK家族的ERK、JNK和p38。4、其他信号转导通路牵拉刺激和化学信号(如心肌组织中生长因子和细胞因子等)还能激活心肌细胞中PI一3K/AKT通路和JAK—STAT通路．促进心肌细胞的增殖和基质成分牵拉刺激和多种化学信号不仅能改变心肌细胞离子通道的开放状态。第69页,共71页，星期六，2024年，5月细胞损伤和应激反应中的信号转导应激激活的信号转导通路：1、应激原：物理性因素，化学性因素，生物性因素2、应激激活的信号转导通路：MAPK家族（SAPK/JNK，P38）应激激活的信号转导通路的靶蛋白胞浆蛋白，PLC,PLA，表皮生长因子受体，转录因子第70页,共71页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第71页,共71页，星期六，2024年，5月磷酸化的信号转导分子酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀,SDS电泳，然而采用Westernblotting鉴定其分子量，进一步利用分子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构和氨基酸序列。第31页,共71页，星期六，2024年，5月免疫学法蛋白质印迹：抗体（如抗p-Thr）、样品匀浆液加入蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑制剂；目标蛋白印迹发生移位免疫组织化学：磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变化流式细胞术：荧光抗体第32页,共71页，星期六，2024年，5月磷酸化蛋白组学高分辨率质谱磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷酸酶）、冈田酸（丝/苏氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油磷酸钠（广谱、非特异磷酸酶）第33页,共71页，星期六，2024年，5月激酶活性的测定常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。检测原理：根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外