生物分离工程-第八章-电泳技术课件.pptVIP

凝胶浓度(C=2.6%)分子量范围(kDa)凝胶浓度(C=5%)分子量范围(kDa)530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150凝胶浓度与分子量测定的关系PAGE的具体操作过程制胶:确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；样品准备:选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；电泳:4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部；检测:紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵敏度比考染高100倍、荧光探针）；照相、凝胶干燥:定量测定:SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定；特点:设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。SDS的原理蛋白质分子的解聚SDS是一种阴离子去污剂,作为变性剂和助溶性试剂,能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂,如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此,在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后,蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链,解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后,形成带负电的蛋白质-SDS胶束,所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量,消除了不同分子间的电荷差异；同时,蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同,这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变未知蛋白质分子量的测定基于上述SDS的原理介绍,我们可以利用SDS电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行SDS电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率,制作标准校正曲线,然后对未知蛋白在相同条件下进行SDS电泳,测定迁移率,从标准曲线得到相应的分子量；载体两性电解质pH梯度等电聚焦等电聚焦（isoelectrofocusing）,IEF 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同,在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。根据建立pH梯度的原理不同,梯度有分为载体两性电解质梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。工作原理蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为,它们在不同的pH环境中带不同数量的正电或负电,只是在某一pH时,蛋白质的净电荷为0,此pH即为该蛋白的等电点（isoelectricpointpI）。蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象,是一个物理化学常数。可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理载体两性电解质pH梯度等电聚焦是在支持介质中加入载体两性电解质,通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度,当带电的蛋白质分子进入该体系时,便会产生移动,并聚集于相当于其等电点的位置。ββ电泳技术

Electrophoresis本章主要知识点电泳的概念电泳的基本原理电泳技术的分类常用的凝胶电泳技术有哪些？电泳装置的基本组成聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程SDS电泳的基本原理及过程琼脂糖电泳的特点及其应用等电聚焦电泳的基本原理双相电泳的概念及其特点学习总体要求掌握电泳概念,电泳速度及凝胶电泳,了解其他几种常见电泳原理及特点,操作及应用。电泳概念ArneTiselius——物理化学家、诺贝尔奖金获得者定义——荷电的胶体粒子在电场中的移动；电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层,离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时,电泳现象变得越明显。因此,电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。电泳的简单原理蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中,它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。Stoke’sLaw（斯托克斯定律）如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，它们与介质的摩擦阻力f相抗衡，这种抗衡服从斯托克斯定律:f=6πrvηv是介质粘度为η中半径为r的颗粒的移动速度。但实际情况中，f还取决于凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至是介质的内渗等。