羊水细胞等贴壁细胞培养及其染色体制作.ppt

****************************************************************注意事项严格无菌操作是培养成功的关键；视细胞分裂旺盛情况加秋水仙素0.2-0.4ug/ml、4-6小时也可考虑收获；在用0.25%EDTA-trypsin消化之前尽量将瓶壁血清洗净，更有利于快速消化；低渗之后每一步均应轻吹打，用力过大可能损失掉较多细胞。第63页,共64页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第64页,共64页，星期六，2024年，5月************************************************************（2）无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或吸管头等可以暂时放置，其它实验用品用完后应及时移出，以利气体流通。实验用品要用70%酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。第31页,共64页，星期六，2024年，5月（3）小心取出无菌实验用品，避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口，不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后，用手夾住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。第32页,共64页，星期六，2024年，5月（4）工作人员应注意自身的安全，必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的无菌操作台（至少两级）。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐物品伤人等。第33页,共64页，星期六，2024年，5月（5）定期检查下列项目：CO2钢瓶内的CO2压力；CO2培养箱内的CO2浓度、温度、及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜，预滤网﹙300小时/预滤网，3000小时/HEPA）。第34页,共64页，星期六，2024年，5月人羊水细胞培养及染色体制备人的羊水细胞能长成单层并可连续进行传代培养，但它们的一些特征与一般成纤维细胞不同。在羊水中存在着各种不同类型的胎儿细胞，依据其外形和生长特征可区分为以下三类：上皮细胞（E）、成纤维细胞（F）和羊水细胞（AF）。第35页,共64页，星期六，2024年，5月E细胞在胰酶消化的连续培养中不再生长，所以在培养过程中的生长期最短。AF细胞在再培养中一开始就长得很好，染色体分析大多用这类细胞。F细胞在再培养中潜在的生长期最长，在较老的羊水培养物中占优势。第36页,共64页，星期六，2024年，5月通常在培养后3—4天（可能更早些）即出现E细胞的集落，它们不适合再培养作染色体分析。大约在第7天出现的AF细胞可被用于染色体制备。如果在培养后第10天还未见长出新的细胞，就应考虑第二次羊膜穿刺。第37页,共64页，星期六，2024年，5月实验用品、实验试剂见实验操作手册第38页,共64页，星期六，2024年，5月内容与方法（一）细胞接种与培养在无菌条件下抽得妊娠18-22周羊水后，注入10ml离心管中，共抽4管约32ml，立即送检进室后，以1500rpm离心10min进无菌室，在无菌操作台上吸去上清液，每管约留0.5ml，吸管打散细胞。制成细胞悬液，再加入约4.5ml完全培养基入管内，吸管轻混匀，移至25cm2方形培养瓶中置含5%CO2的37℃温箱行开放式培养第39页,共64页，星期六，2024年，5月一般5天后镜下观察，可见成纤维样或上皮细胞生长，当细胞生长旺盛，在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时，视情况（有较好的梭形细胞克隆）可换上换液用培养基，继续培养24-48小时，如细胞生长状况好，即可加入秋水仙素0.04ug-0.08ug/ml,(20ug/ml，7号针头垂直加2滴)4-6小时左右行细胞学处理第40页,共64页，星期六，2024年，5月（二）细胞收获倒出瓶中细胞液入10ml离心管，0.85%NaCl冲洗细胞壁两遍0.25%EDTA-trypsin消化3-5分钟，待细胞面出现肉眼可见皱形改变时即用吸管吹打细胞。收集细胞悬液：离心，1500rpm，10min，去上清第41页,共64页，星期六，2024年，5月低渗：加入0.075MKCl4ml-6ml，吸管吹打，37℃水浴3min-5min(