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分子生物学诊断技术概述

（中国器审2024年07月18日）

检验医学是医学的重要组成部分，为临床对疾病预防、诊断、治疗和预后判断等提供重要信息。随着医学技术和医疗设备的不断发展，分子诊断学技术在检验医学中的应用越来越广泛。分子诊断学是利用分子生物学理论、技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子及其体系的存在与否及其结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据，从而为个体化医疗提供数据支持。

经过多年的发展，分子诊断学技术主要分为分子杂交技术、PCR技术、以及基因测序技术等。由于分子诊断学技术在疾病诊断方面有快速、准确的优点，其在检验医学中具有重要地位。

一、基于核酸分子杂交技术的检测技术

核酸分子杂交技术是指不同来源的2条核酸单链，在一定条件下，按照碱基互补配对原则形成双链的技术，主要包括荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，FISH)、菌落原位杂交技术、Northern印迹法、斑点杂交技术、芯片杂交技术、Southern印迹法等。其中，FISH技术指在人体的染色体?组织或者细胞上，将荧光素标记的探针按照碱基互补配对原则，使得靶基因得以显示。

FISH技术自问世以来，被迅速应用于检测各种类型的细胞遗传学的改变，包括染色体拷贝数异常、复制、扩增、缺失、倒位和易位等。同时，它也是临床疾病诊断的重要手段，如肿瘤检测、对染色体非整倍性异常引起的不孕不育检测等。美国医学遗传学学会于1993年发布了应用FISH进行产前诊断的相关说明，FISH技术在我国也应用于临床多年，主要应用于癌症辅助诊断、产前诊断等领域等。FISH技术在产前诊断领域作为核型分析技术的补充已成为专家共识。现批准上市产品有HER-2基因扩增检测试剂盒、ALK基因重排检测试剂盒、PML/RARα融合基因检测试剂盒、13/16/18/21/22/X/Y染色体数目检测试剂盒等。

基因芯片是利用原位合成或者显微点样技术，将很多DNA探针按照顺序固定在支持物的表面，然后与进行标记的样本进行杂交，并且将杂交后获取的信号进行分析，从而能够获得样品的基因排列顺序和基因表达等信息。根据不同的基因芯片制作方法，基因芯片可以被分为两大类，一类是原位合成的芯片，另一类是DNA微阵列。根据基因芯片上探针的种类的不同，基因芯片还可以称作是寡核苷酸芯片?cDNA芯片?DNA芯片等。具有高密度特性的寡核苷酸芯片，主要采用的方法就是原位合成，具有低密度特性的芯片采用的是点样方法，而cDNA芯片和DNA芯片只能采用点样的方法制成。由于基因芯片技术具有自动化程度高?操作简单?通量高等特点，在基因分型?基因表达?单核苷酸多态性检测等方面均有广泛应用。现批准上市产品有葡萄糖6磷酸脱氢酶基因突变检测试剂盒(基因芯片法)、人乳头瘤病毒分型检测试剂盒（基因芯片法）、人乳头瘤病毒（20个型）基因分型检测试剂盒（PCR-电化学基因芯片法）、电化学基因芯片检测仪等。

二、基于PCR技术的检测技术

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)，是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法，包括变性-退火-延伸三个基本反应步骤。PCR技术由于具有速度快?操作方便?灵敏度高?标本要求低以及特异性高等特点，在食品检验?医学?农学等领域均得到广泛应用。随着技术的发展，除常规聚合酶链反应技术外，PCR技术已经衍生出很多不同的细分技术，例如实时荧光定量PCR(real-timequantitativepolymerasechainreaction，qPCR)、逆转录PCR（ReversetranscriptionPCR（RT-PCR）、逆转录实时荧光定量PCR（Real-timequantitativeRT-PCR，real-timeRT-PCR（或RT-qPCR））、数字PCR(digitalPCR，dPCR)、多重PCR（MultiplexPolymeraseChainReaction，mPCR）也称复合PCR、反向PCR（Inverse-PCR）等；恒温扩增的技术还可以细分很多如LAMP、RPA、RCA、CPA、SDA和HDA。

按照PCR技术的演进，人们习惯性的将PCR技术划分为三代：普通PCR技术，实时荧光定量PCR技术（qPCR）和数字PCR技术（dPCR）。普通PCR技术是经典方法，国际和国内标准齐全；仪器试剂成本较低，用于定性分析；qPCR技术具有方法成熟，配套仪器试剂齐全，试剂成本中等，操作简单，检测敏感性高，特异性高，可实现半定量检测；dPCR技术可以实