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PCR的应用

随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室。PCR技

术应用广泛，如实时荧光定量RT－PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢

式PCR等，高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。各种PCR技

术不是孤立的，它们均以常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自

的局限性，因此在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR

等。

在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解答步骤：一是

寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可

能的意图；三是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框

架进行完善。

1．实时荧光定量RT－PCR技术检测病毒核酸

病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外

添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，

不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q

分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检

测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓

度越高。

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2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术

重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处

代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在

随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR

技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、

AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：

3．PCR定点突变——大引物PCR技术

大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游

引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整

的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游

大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。

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4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列

当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。

原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得

了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向

的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序

列。原理如图。

5．巢式PCR

首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似

结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种