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纳米孔单分子测序技术及其应用简介

（中国器审2024年08月15日）

单分子测序（Single-moleculeSequencing，SMS）是在第一代Sanger测序、第二代NGS高通量测序技术的基础上发展起来的第三代测序技术。因其测序时DNA分子无需PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序而得名。HelicoBioscices公司基于合成测序理论于2008年推出了世界上第一款单分子测序平台HeliScope，但其测序的平均读长相对较短，系统整体测序错误率较高[1]。之后出现了单分子的长读长测序技术，目前已经实现商业化的长读长测序技术主要有PacificBiosciences（PacBio）公司的单分子实时测序技术（Single-moleculeReal-time，SMRT）和OxfordNanopore公司（OxfordNanoporeTechnologies，ONT）的纳米孔测序技术[2]。SMS和SMRT技术主要是将４种不同的碱基转化为荧光信号，然后通过转化放大后的信号对碱基进行区分。而纳米孔测序技术则是将４种碱基转换为电信号，然后对电信号进行收集、整理、转化与数据输出，与单分子荧光测序技术在信号处理上存在较大差异，故而纳米孔测序技术也被称为第四代测序技术。本文将主要介绍纳米孔单分子测序技术的原理、特点及其在体外诊断领域的应用。

一、纳米孔测序的原理

纳米孔单分子测序技术是基于电信号测序的技术，相对于其他测序技术，纳米孔测序技术的样本处理极其简单，无需DNA聚合酶或者连接酶，也无需dNTPs，其测序过程中包含了以下几种关键物质，如图1、图2所示。

纳米孔蛋白（Nanopore），可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。

多聚物薄膜（Membrane），跨膜蛋白会被嵌入到高电阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。

马达蛋白（Motorprotein），在纳米孔测序文库构建时，需要在接头上连接一种马达蛋白，用于将DNA或RNA分子推入纳米孔中。

连接臂（Tether），用于锚定DNA或RNA链，防止其在溶液中飘动，并使其进入纳米孔中。

将人工合成的多聚物膜浸没在离子溶液中，膜上布满了由解旋酶和蛋白孔两部分组成的跨膜通道蛋白纳米孔，在膜两侧施加不同电压形成电压差。由于多聚物膜不可导电，电流只能通过纳米孔进行传导。连接臂引导待测链进入纳米孔，待测链在马达蛋白的牵引下经解螺旋后以单链形式穿过纳米孔（如图1）。不同碱基在通过纳米孔的恒定的电场时会引起电流不同幅度的变化，使用计算机软件及人工智能算法识别并推断出碱基类型，从而完成了DNA或RNA的测序[3]（如图2）。

二、纳米孔的类型

1.生物纳米孔

纳米孔测序的概念首次在80年代被提出，并且随着纳米孔蛋白及马达蛋白的技术发展而得以实现。第一个被发现可以通过DNA或RNA影响离子电流并能使之被检测到的纳米孔蛋白是1996年Kasianowicz等提出的α-溶血素蛋白[4]。但是因DNA通过纳米孔的速率过快，而无法获得有效的电流信号。之后的2010年，耻垢分枝杆菌蛋白A（Msp-A）纳米孔被发现可以减缓DNA穿过纳米孔的速度，提高DNA单碱基的检测灵敏度[5]。随后，2014年研究者发现使用phi29DNA聚合酶作为马达蛋白[6]，可以控制DNA穿过纳米孔的速度。

生物纳米孔主要包含以上3种，均为由某种蛋白质分子镶嵌在磷脂膜上形成的天然纳米孔，可以进行灵活的生物化学修饰。然而生物纳米孔在膜稳定性、电流噪声等方面的问题在一定程度上限制了其发展。牛津纳米孔公司在蛋白纳米孔的应用方面取得了一定进展，他们的GridION和MinION系统就是基于生物蛋白纳米孔的测序平台。?

2.?固态纳米孔

Li等在2001年开启了固态纳米孔的研究[7]。固态纳米孔主要是在氧化硅、石墨烯等固态材质上通过离子束刻蚀等技术制备出的纳米孔，因其尺寸可调、可靠性高、易修改等优点，被广泛应用于DNA测序、蛋白质检测和能量转换等研究领域[8]，其中比较常见用于DNA检测的固态纳米孔是氮化硅纳米孔和石墨烯纳米孔。

相比于生物纳米孔，固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显着的优势，但是因为受限于如今的半导体工艺制造水平，固态纳米孔的制造还较为复杂与昂贵。

三、纳米孔测序的特点

相比于其他测序平台，纳米孔测序作为一种新型测序技术在成本、速度、读长和准确率等诸多方面有着不同的特点，其优势十分显著，主要可以概括为以下几点：

1.较长的测序读长

纳米孔测序技术利用碱基穿过纳米孔时电信号的