细胞工程制药技术.ppt

3.细胞壁再生及细胞分裂：l-3天即再生新细胞壁，表现为体积增加、膨大，再由圆变椭圆。可用质壁分离法证实。也可用0.1%ST型或WBL型荧光增白剂染色，经前者染色，有细胞壁者在荧光显微镜下呈蓝色荧光。经后者染色，有细胞壁者发射绿色荧光。在原生质培养过程中，胞质增加，液泡减少，叶绿体或颗粒内含物分散于泡质中或围绕于细胞核周围．常在1一2周内发生第一次分裂。不同细胞分裂频率不同。第63页,共81页，星期六，2024年，5月4、愈伤组织或胚状体形成原生质体再生的细胞一旦开始分裂，就可能继续生长：A形成细胞团，发育成愈伤组织；B.形成胚状体，再产生植株；C.形成愈伤组织，再形成胚状体。随着细胞分裂及细胞团形成，已与常规细胞和组织培养相同，故培养3—4周需添加含一定量低渗稳定剂的新培养基，以满足细胞的营养，亦利于细胞团及小愈伤组织的生长。第64页,共81页，星期六，2024年，5月5.植株再生大多经愈伤组织诱导分化再生为完整植株。当愈伤组织达到1—2mm时，转移至分化培养基上诱导器官分化。分化培养基与原生质体培养基差别在于：(1)只用蔗糖为碳源，不加渗透稳定剂；(2)与原生质体培养基相反，细胞分裂素浓度高于生长素;(3)在诱导器官分化过程中，一般采用15001x左右的高光强。诱导器官分化的温度与原生质体培养基本相同。第65页,共81页，星期六，2024年，5月（三）原生质体培养的目的：1、利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取，原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。2、是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。3、也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。第66页,共81页，星期六，2024年，5月A-E,培养的欧当归(LevisticumofficinaleKoch))原生质体分裂再生成植株的过程F-L,培养过程的核变化；F.多核，G.核穿壁，H.无丝分裂，I.染色体桥，J.2n=22，K.L.多倍体.A-D当归(Angelicasinensis(Oliv)Diels)原生质体培养成再生苗E-H,红豆草(OnobrychisvicaefoliaScop))原生质体培养再生植株第67页,共81页，星期六，2024年，5月第68页,共81页，星期六，2024年，5月第69页,共81页，星期六，2024年，5月第70页,共81页，星期六，2024年，5月（四）原生质体融合：在外界因素作用下，两个或两个以上植物细胞合并成一个多核细胞的过程称为植物细胞融合，或植物体细胞杂交。但由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，不能直接融合，需经酶消化除去细胞壁释放出原生质体，后者生理、生化及遗传学特性与完整细胞基本相同。在适当条件下来源不同的植物原生质体可产生融合作用，并可再生细胞壁，形成完整植株。第71页,共81页，星期六，2024年，5月1、作用：(1)可实现远缘杂交，获得种间杂种，克服有性杂交配子不亲合性；(2)可获得含另一亲本非整倍体杂种或胞质杂种，且获得的遗传变异范围极广；(3)一次操作可实现两个以上亲本的融合作用(4)可获得呈现双亲个体基因型总和的杂种；(5)可形成有性生殖障碍植物的种间杂种；第72页,共81页，星期六，2024年，5月2.促融因素：（1）NaNO3诱导，NaNO3可中和原生质体表面负电荷，促进原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合率低；（2）高Ca2＋和高pH值诱导；（3）PEG（聚乙二醇）诱导，在高浓度PEG溶液中，原生质体发生聚集作用，经稀释后，50％以上原生质体发生融合作用；（4）高Ca2+、高pH值及PEG结合诱导法。（5）其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及电场诱导等融合方法。第73页,共81页，星期六，2024年，5月融合过程：高密度混合2X105个/ml第74页,共81页，星期六，2024年，5月3.影响融合的因素：PEG,高Ca2+高pH处理时间。4.杂种细胞的筛选：（1）遗传互补筛选（2）抗性互补筛选（3）机械筛选5、杂种植株的选择：可利用形态、细胞、生化及分子手段鉴定第75页,共81页，星期六，2024年，5月第76页,共81页，星期六，2024年，5月四、微生物原生质体融合（一）标记菌种筛选和稳定性鉴定营养缺陷型菌株选择性培养