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荧光定量PCR

PCR(polymerasechainreaction)聚合酶链式反应，又称体

外DNA扩增技术，在1985年由美国Cetus公司的KaryMullis

首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。Kary

Mullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。

荧光定量PCR（Real-timePCR），是指在PCR扩增反应体系

中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号

的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方

法。

一、荧光定量PCR原理

以探针法荧光定量PCR为例：PCR扩增时在加入一对引物

的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针两端分别标记一个

报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。开始时，探针完整地结合

在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基

团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，Taq酶将探针酶切

降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系

统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光

分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

传统的PCR进行检测时，扩增反应后需要进行染色处理

及电泳分离，并且只能作定性分析，不能准确定量，易造成污

染出现假阳性，使其应用受到限制。实时定量PCR技术不仅

实现了对模板的定量，且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、

自动化程度高和无污染的特点，使得荧光定量PCR逐渐取代

常规PCR。

在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，

接近一条直线，这样的直线即是基线，这条线是可以自动生成

也可以手动设置的。之后反应会进入指数增长期，这个期间扩

增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，

它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将

荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差

的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历

的循环数被称为CT值，这个值与起始浓度的对数成线性关系，

且该值具有重现性。

Ct值最大的意义就是用来计算目的基因的表达量，此时就

有两个概念容易被提及，那就是绝对定量和相对定量，绝对定

量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的

拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中

的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝

数。

Ct值诚然可以被利用来计算这两种定量结果，但是绝对定

量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。

相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。绝对标准品

制作困难难以获取，实验室基本都是选择相对定量的方法来计

算相对基因表达量。

二、荧光定量PCR中的对照

对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照

检测的流程对对照进行梳理。

常规荧光定量PCR的流程是：样品采集-运输-样品处理-

核酸提取-反转录（RNA病毒）-扩增-结果读取。

下面看看各个环节都可以使用哪些对照？

1、阳性对照和阴性对照阳性对照和阴性对照是指在相同

的处理条件下，比如一份已知的感染样品和一份已知的未感染

样品，都进行了提取和扩增最终获得了阳性结果和阴性结果。

阴阳性对照强调处理过程与样品一致，并且有明确的预期结

果。

2、扩增对照我们通常说的阳性对照和阴性对照指的是扩

增试剂盒中附带的不需要提取的阳性对照和阴性对照，更准确

的定义应该是扩增阳性对照和扩增阴性对照。扩增阳性对照含

有阳性扩增模板，扩增阴性对照应含有阴性扩增模板（基质核

酸）。扩增对照只能监控每次扩增过程中的扩增系统是否正常，

不能监控采样、提取和每份样品的操作过程。如果是检测RNA

样品的检测试剂盒，其扩增阳性对照使用质粒，便无法监控反

转录过程。

3、内标（InternalControl，IC）内标是指在同一反应管中与

靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式，一种

是使用天然样品中含有的内参基因作为内标，