细胞破碎技术.ppt

研磨法第96页,共127页，星期六，2024年，5月原理最早在实验室用的研磨法是使用氧化铝，也可用细玻璃粉或石英粉作为研磨剂，其颗粒大小为0.1nm。先将细胞和研磨剂按1比5的比例混合均匀，预冷后放入研钵，手持研磨杵进行研磨。依靠在压力下推动固体与细胞的挤压与磨擦使细胞壁破碎。该法简便，但效率低，处理量小。只能在实验室中使用。根据这个原理,设计了细菌磨。细菌磨结构示意图主要由研磨和动力两部分构成。研磨部分包括滚筒和承座。滚筒是长15cm，直径5cm，厚度为2nm以上的硬质磨砂玻璃管；承座是能与玻璃滚筒的半面密切贴合的凹型硬质瓷座。玻璃滚筒两端用橡皮塞密封，一端带有被动轮的钢轴通过橡皮塞中心贯穿玻璃滚筒，滚筒与瓷承座不但要密切吻合，且必须互相贴紧。因此，在瓷承座下必须垫以强有力的弹簧或富有弹性的橡胶。玻璃滚筒内可加入冰块，以便降温；瓷承坐也可制成中空的，接上进出口，可以通入冷却水，以便控制研磨细胞时的温度。动力部分是一小马达，由皮带与被动轮传动，减速后，滚筒转速为120-130r/min。第97页,共127页，星期六，2024年，5月操作将湿菌体与1.3-1.5倍重量的直径在3mm以下的玻璃粉研磨剂共置一研钵内，冷却至5℃以下，迅速将玻璃粉和湿细胞混合均匀，研压成块，用不锈钢勺取5g左右的混合物，自旋转的滚筒前边加入并迅速挤压，使混合物随滚筒进入磨中，随即压挤附着在滚筒表面形成薄层，研磨20-30sec，用一长方形玻璃片横置于滚筒面上，将研磨的混合物自滚筒上刮下。研磨混合物中的水量极为重要，太少时混合物不能附着在滚筒上，太多时研磨破碎效率大幅度降低。因此，研磨混合物制备时的水量应根据细胞的干湿加以控制。破碎率可通过破碎时间加以掌握，一般也可达到95%以上的破碎率。利用该法破碎细胞的效率低，它只适于实验室和小量制备。但其适用范围较广，可破碎细菌，酵母，真菌，甚至动植物组织。第98页,共127页，星期六，2024年，5月干燥提取法第99页,共127页，星期六，2024年，5月该法适合提取酵母中比较稳定的酶。通过干燥使细胞膜的渗透性改变，从而使细胞内某些物质容易抽提。干燥的方法包括空气干燥、真空干燥、冷冻干燥和水溶性有机溶剂脱水干燥等。空气干燥一般是在25-30℃或高至35-40℃的干燥气流中吹干，将干细胞再悬浮在3-5倍的水或缓冲液中，室温下搅拌2-3h抽提。抽提的缓冲液pH在8-9时比7.0时抽提的可溶性蛋白质较多；如果目的蛋白质稳定性较高，可在40-45℃下抽提；如果目的蛋白质不稳定，需在较低的温度下处理。一般来说，空气干燥的细胞提取的蛋白质要比真空干燥和冷冻干燥的多，这是由于在空气干燥时细胞会发生自溶的原故。在有机溶剂脱水干燥时使用的有机溶剂有丙酮及二氧六环。通常将十倍于细胞悬浮液的有机溶剂预冷至-20℃，在搅拌下将细胞悬浮液缓慢倒入有机溶剂，停止搅拌，静止使之自然沉降，倾去上清，用布氏漏斗真空过滤，滤饼用冷的有机溶剂洗涤，抽干后，立即放入内放有石蜡真空干燥器，吸附残余的有机溶剂。干燥的细胞可采用上述的抽提方法进行处理。由于有机溶剂将细胞膜上的脂类物质去除，改善了通透性，有利于酶的提取。第100页,共127页，星期六，2024年，5月冻融法第101页,共127页，星期六，2024年，5月此法是利用细胞含有大量水份，在快速冷冻时，细胞内水很快结晶，形成大量晶核，体积增大，将细胞胀破，达到破碎细胞的目的。一般是将40-70%的细胞悬浮液放入低温冰箱使之快速冷冻，冻结后，取出在室温下融化，然后再冷冻，反复进行，通常需三次以上，酶的释放率才可能达到满意。此法主要适用于大肠杆菌和细胞壁较薄的细菌，特别适用于位胞间质的酶的释放。冻融法十分简便，不需特殊设备，在实验室中使用很方便，但耗时，耗能，大规模应用困难。第102页,共127页，星期六，2024年，5月化学法某些有机溶剂、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂、抗生素等化学试剂可以改变细胞壁或膜结构的通透性，使胞内物质有选择性的渗透出来，因此，将这种处理方法统称为化学法。第103页,共127页，星期六，2024年，5月有机溶剂法使用非水溶性的有机溶剂，如醋酸乙酯、苯、甲苯、乙醚或氯仿处理使细胞脱脂，改变其渗透性，或使细胞自溶。例如甲苯能溶解