细胞培养技术实用篇.ppt

细胞计数操作步骤按下式计算：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×稀释倍数×104/ml公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而1ml＝1000mm3。第89页,共112页，星期六，2024年，5月细胞计数注意事项要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更应该每次取样都要混匀，以求计数准确。第90页,共112页，星期六，2024年，5月细胞计数注意事项数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。第91页,共112页，星期六，2024年，5月台盼蓝染色法在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，活细胞所占总细胞中的百分比叫做细胞活力。由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。细胞死亡后，细胞膜通透性改变，台盼蓝大量进入细胞内而不被排出呈蓝色。活细胞选择性强，不易着色第92页,共112页，星期六，2024年，5月台盼蓝染色法0.5ml台盼蓝＋0.3ml培养液＋0.2ml细胞悬液染色5－15min至少计数500个细胞中着色细胞数细胞活力=（总细胞数－着色细胞)/总细胞数×100％第93页,共112页，星期六，2024年，5月噻唑蓝（MTT）比色法原理：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶于水的蓝紫色产物颗粒（formazan)，并沉积在细胞中。二甲基亚砜（DMSO）或酸性异丙醇能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅（以OD值表示）与所含的formazan量成正比。可反映活细胞的代谢水平。而死细胞没有这种功能MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等第94页,共112页，星期六，2024年，5月噻唑蓝（MTT）比色法加入培养液量10％的MTT(5g/L)，继续3～4h培养吸去培养液，加入等量异丙醇或DMSO，振荡10min490/630nm测定OD值细胞存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％第95页,共112页，星期六，2024年，5月细胞生长曲线法观察同一代细胞的增殖过程，根据细胞生长曲线分析细胞的增殖速度，确定具体实验、细胞传代、细胞冻存的最佳时间第96页,共112页，星期六，2024年，5月细胞生长曲线法计数细胞浓度，等量加入培养板各孔，培养7天以接种时间始，每隔24h计数3孔细胞数目，取均值以横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度（×104/ml)注：1、各孔消化时间应一致。2、计数细胞前应混匀。第97页,共112页，星期六，2024年，5月第98页,共112页，星期六，2024年，5月[3H]-TdR掺入法和BrdU掺入法[3H]-TdR掺入法是将用[3H]标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到新合成的DNA中，通过测定[3H]放射性脉冲数比较不同细胞的增殖活性。溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU）是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。BrdU被掺入到DNA复制位点，这些复制位点可用荧光剂或酶偶联的抗体检测。第99页,共112页，星期六，2024年，5月七、细胞冻存和复苏细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。第100页,共112页，星期六，2024年，5月冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶