细胞生物学研究方法专题座.ppt

五、分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。（一）原位杂交（insituhybridization）。用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了免疫探针法。第96页,共103页，星期六，2024年，5月原位杂交技术第97页,共103页，星期六，2024年，5月（二）Southern杂交是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。第98页,共103页，星期六，2024年，5月六、PCR技术PCR即：polymerasechainreaction。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），约15-20个核苷酸；③4种dNTP；④TagDNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermusaquaticus，最适作用温度75~80℃，短时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+。反应过程：①变性：约90-95℃；②复性：约60℃左右；③延伸：70-75℃；④重复“变性——复性——延伸”过程20-30次循环。第99页,共103页，星期六，2024年，5月PCR原理第100页,共103页，星期六，2024年，5月PCR的应用:合成基因、基因的定点突变、考古研究、法医学、疾病诊断电泳成像分析图第101页,共103页，星期六，2024年，5月七、基因作图与人类基因组计划HumanGenomeProject,HGP:用15年时间测出24条染色体DNA的全部核苷酸序列,阐明人类遗传信息的组成及其约3~5万个基因的结构和定位.第102页,共103页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第103页,共103页，星期六，2024年，5月STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu第64页,共103页，星期六，2024年，5月三、显微操作技术

micromanipulationtechnique在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。第65页,共103页，星期六，2024年，5月显微操作仪第66页,共103页，星期六，2024年，5月第67页,共103页，星期六，2024年，5月第二节细胞分离技术第68页,共103页，星期六，2024年，5月一、离心技术是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。第69页,共103页，星期六，2024年，5月（一）差速离心Differentialcentrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。第70页,共103页，星期六，2024年，5月LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation第71页,共103页，星期六，2024年，5月（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）pH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。第72页,共103页，星期六，2024年，5月CsCl密度梯度离心分离DNA第73页