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胎盘蜕膜间充质干细胞分离培养SOP

一、样本接收

1.正常足月顺产男婴，与产妇及其家属签署知情同意书后，在产房无菌条件下

获取胎盘，放至无菌袋中，4℃运输至细胞中心。

2.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。

3.查看客户信息是否与交接表一致。

4.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，

传入洁净区准备制备。

二、胎盘蜕膜间充质干细胞分离与接种

1.准备耗材试剂：15cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml

移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、封口膜、100目滤网过筛、灭菌手术刀、

灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、DPBS、

双抗、75%酒精（已过滤）、Ⅰ型胶原酶。

2.仪器设备准备及预热：生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机、电动移液器、

倒置相差显微镜、摇床（37℃150r/min）。

3.将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。

4.将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜

中，实验中所需要的相关试剂及耗材等喷酒精擦拭放入生物安全柜中。

5.取无菌托盘，加入含1%青链霉素的DPBS，将胎盘组织放入其中，并取适量样

本保存液留样送检支原体。并洗涤组织两三次，洗去表面的血污，直至清洗的液体

无血色。

6.清洗结束后，将胎盘放入无菌托盘中，然后使用无菌剪刀分离胎盘底部靠近

3

母体一侧的蜕膜组织，再将蜕膜组织剪碎至1-3mm的微小组织块，加DPBS定容离心，

500g5min。

7.离心结束后，去上清。按照蜕膜组织与消化液体积比为2:5的比例加入消化酶，

在37℃150r/min的条件下震荡消化至少一个小时，再按消化酶与0.05%的胰酶体积

比为1:1的比例加入0.05%的胰酶，在37℃150r/min的条件下震荡消化15min。

8.用无血清干细胞培养基终止消化，吹打悬液20-30次，打散组织，混匀细胞，

将消化的组织液通过100um细胞筛网过滤出组织和胎盘蜕膜间充质干细胞两部分，

组织留在滤网上，下层则是细胞悬液，加DPBS定容混匀离心。

9.离心结束后，去上清。加入红细胞裂解液，去除红细胞，然后加DPBS定容

混匀离心（若沉淀无红细胞则可不使用红裂）。

10.离心结束后，去上清，重悬细胞沉淀，取样细胞计数，根据细胞数量计算接

种瓶数，接种于培养瓶。

11.晃动培养瓶将细胞匀分布于整个底面，并在培养瓶上记录好操作信息，平置

放入37℃5%的二氧化碳培养箱中培养。

12.清场，将安全柜中的试剂耗材喷酒精擦拭并拿出，按其储存条件放回对应的

环境中，培养基放到4℃冰箱中避光，移液管放回推车上。拉下玻璃窗，开紫外定时

30min。收垃圾，更换垃圾袋。将收集的垃圾打包到医疗垃圾暂存库。

三、细胞培养换液

1.1.准备耗材试剂：10ml移液管、无尘布、废液缸、无血清干细胞培养基（常

温复温）、75%酒精。

2.仪器设备准备及预热：生物安全柜、二氧化碳培养箱、电动移液器、倒置相

差显微镜。

3.生物安全柜开紫外30min通风10min，将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭

台面，包括侧面及玻璃。

4.2-3天后，在倒置显微镜下观察细胞，若细胞融合度未达到80-90%，则进行

换液，若达到则就行传代。

5.将换液所需要的培养基、移液管、移液枪喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，

将T75瓶的盖子拧开，倒放在远离操作中心区的离心管架上，用移液管吸弃旧的培

养基，再加入等量的新鲜的干细胞完全培养基，拧上盖子。

6.在培养瓶上记录好操作信息，平置放入37℃5%的二氧化碳培养箱中培养。

7.预估下次换液或传代的时间。

8.清场，将安全柜中的试剂耗材喷酒精擦拭并拿出，按其储存条件放回对应的

环境中，培养基放到4℃冰箱中避光，移液管放回推车上。拉下玻璃窗，开紫外定时

30min。收垃圾，更换垃圾袋。将收集的垃圾打包到医疗垃圾暂存库。

四、原代细胞收获传代（P0-P1）

1.在培养箱