牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化一.pdfVIP

牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠

杆菌中的融合表达和纯化（一）

论文关键词：牙龈卟啉单胞菌菌毛大肠杆菌表达系统

融合蛋白固定化金属螯合亲和层析

论文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我国有很高的发病率，

严重影响国民健康水平。慢性牙周炎不仅是致使成人牙齿功能丧失的

主要原因之一，而且还可能是某些系统性疾病的危险因素。慢性牙周

炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,

Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）是Pg的重要致病因子，

可介导Pg附着于口腔内各类组织细胞的表面，以有利于Pg在体内进

一步的粘附和侵袭；可引发炎症反映和免疫反映。而且菌毛具有良好

的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。目前，慢性牙周炎的医

治效果还不睬想，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意

义。

研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达FimA蛋白并进行蛋

白纯化。为后续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体提供实验基础。

研究方式：1.以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为宿主菌，用

IPTG诱导fimA表达，通过SDS和Westernblot来验证蛋白的

表达结果，并进行蛋白表达形式分析。2.大量诱导表达融合蛋白，

用Co2+柱亲和层析纯化表达产物，通过SDS和Westernblot

来验证纯化产物，纯化产物经透析复性后用BCA法蛋白定量试剂盒

作蛋白含量测定。

研究结果：1.经IPTG诱导表达后，工程菌在SDS

上出现一条新蛋白带，分子量与预期大小大体一致（约41kDa），IPTG

浓度及诱导时间对融合蛋白表达量影响较大：当IPTG浓度为2

mmol/L，诱导时间为3h时蛋白表达量最大；当IPTG浓度为1

mmol/L，诱导时间为1h时蛋白表达量最小。6×His-FimA表达产物

经SDS后，转移至硝酸纤维素膜，X线片感光，在X线片上

相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pET-15b

对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白

位于包涵体中。2.表达产物经Co2+柱亲和层析，SDS上出

现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kDa）。6×

His-FimA纯化产物经SDS后，转移至硝酸纤维素膜，X线片

感光，在X线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，

条带位置与BL21(DE3)pLysS全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经

BCA法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算

出纯化后的FimA蛋白浓度为mg/ml。

主要结论：用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质

粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA

基因能够取得正确表达。表达产物经Co2+柱亲和层析，可以取得带

6×His标签的FimA融合蛋白。

1绪论

慢性牙周炎是致使成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我

国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织

的破坏是持续性的，一旦发生，目前的医治手腕还不能使牙周组织达

到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统性疾病的危险因素。随着我

国经济的发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延长，对牙周健康

状况的关注日趋提高。因此，探索预防慢性牙周炎的有效途径对于提

高国民健康水平具有重要意义。

疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用，是一种有效

的防治疾病的手腕。从减毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗

到DNA疫苗，由于技术不断改良，使得疫苗有了普遍的应用，被成

功的用于许多细菌或病毒感染的防治，因此以疫苗来防治牙周炎也已

成为一个重要思路。

慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌

(Porphyromonasgingivalis,Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面

主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，FimA)是其主要亚单位，能

够介导Pg对宿主组织的粘附与入侵，和与口内其他细菌的粘附共聚

[1-3]，还能刺激炎性因子的产生[4]。多菌毛Pg野生