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编辑课件
一.实验目的
1.掌握细胞反响动力学的研究方法;
2.稳固复原糖和生物量的测定原理与方法;
3.掌握酶反响速度的实验测定方法;
4.掌握最大反响速度rmax和米氏常数Km的测定方法。
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二.实验原理
对细胞反响:
实验可得不同t的底物浓度Cs值和Cx值(细胞浓度)。
要求动力学参数KS,μmax;必求μ,
——测定时间区间△t内细胞浓度平均值。
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碱性磷酸酶碱性条件下,催化磷酸单酯水解。根据酶催化反响机理:
可推导出米氏方程:
通过测定不同底物浓度CS下的反响速度r,可确定rmax和Km。
ONa
催化反响:│OH
O-P==O
││碱性磷酸酶│
+HO
ONa2+NaHPO
24
一定pH、T
OH
│铁氰化钾
+AAP醌类化合物〔红色〕
OH-
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在510nm波长处比色测定OD值,从而计算出酶的活性〔反响速度r〕。
三.菌种、培养基、实验试剂和主要仪器
1.枯草芽孢杆菌AS1.398
2.Tris-培养基:葡萄糖0.4%;NaCl0.5%;〔NH4〕2SO41%;KCl0.1%;
CaCl20.1mmol/L;MgCl21mmol/L;Na2HPO420μmol/L;酪蛋白水解物
0.1%,溶于0.1mol/LTris-HCl缓冲液〔pH7.4〕中。分装于150ml三角瓶
中,每瓶装50ml,于115℃,灭菌30min,冷却。〔周二下午做)
3.0.1mol/LTris-HCl缓冲液〔pH7.4〕4.0.1mol/LpH8.8Tris-醋酸缓
冲液5.40mmol/L底物溶液6.0.5mol/L氢氧化钠溶液7.0.3%〔W/V
〕4-氨基安替比林〔AAP〕溶液8.0.5%〔W/V〕铁氰化钾溶液9.3,5
-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)10.1mg/ml葡萄糖标准液11.甲苯
12.移液管,刻度试管,容量瓶,滤纸,三角瓶,布式漏斗,电子天平,
恒温水浴槽,摇床,枯燥箱,721分光光度计,灭菌锅,冰箱。
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四.实验方法与步骤
1.种子液制备〔以班为单位〕
枯草杆菌在固体斜面培养基上活化后。接入8个装有50ml
Tris-培养基的150ml三角瓶中,于30℃振荡培养18h作为种子液。
〔周三下午2:30做)
2.发酵液制备〔以组为单位〕
将上述培养好的种子液接入10个装有50mlTris-培养基的
150ml三角瓶中,接种量5%〔v:v〕,于37℃振荡培养0h、1h、
2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h(发酵到上述每一
定时间取一瓶,测定发酵液的残糖含量和生物量,测定原理与方
法见附录一,二)。
表1发酵动力学实验数据
培养时间(hr)0122.533.544.555.5
生物量mg/ml
残糖mg/ml编辑课件
3.枯
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