正常和肿瘤组织细胞的培养.pptVIP

1500rpm,20℃,30minPBMC红细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、血小板第44页,共79页,编辑于2022年,星期一（二）纯淋巴细胞的制备1.玻璃黏附法2.羰基铁粉法第45页,共79页,编辑于2022年,星期一（三）T、B淋巴细胞的分离1.T细胞花环沉降法2.尼龙毛柱分离法第46页,共79页,编辑于2022年,星期一（四）大颗粒淋巴细胞的分离（五）FACS仪分离（六）免疫磁珠法第47页,共79页,编辑于2022年,星期一

三、血淋巴细胞的体外培养应用第48页,共79页,编辑于2022年,星期一（一）淋巴细胞转化试验（二）B细胞产生Ig的检查（三）T细胞介导的细胞毒试验（四）NK细胞毒性试验（五）K细胞毒性试验（六）LAK细胞的制备（七）TIL细胞的制备第49页,共79页,编辑于2022年,星期一（八）淋巴细胞的体外长期培养1.用IL-2建立T淋巴细胞克隆2.用EB病毒转化B淋巴细胞3.用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株第50页,共79页,编辑于2022年,星期一肿瘤细胞体外培养第51页,共79页,编辑于2022年,星期一肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点:

肿瘤细胞在体外的生长生物学特性㈠形态和性状

培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态,大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰,核膜、核仁轮廓明显,核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密,微丝走行不如正常细胞规则,可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。

第52页,共79页,编辑于2022年,星期一㈡生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性,在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖,是因血清中含有很细胞增殖生长的因子,而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后,出现能在低血清培养基中生长的现象,已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时,形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时,接触抑制消除,细胞能相互重叠向三维空间发展,形成堆积物。

第53页,共79页,编辑于2022年,星期一永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3.Rat－1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。㈢肿瘤细胞永生性第54页,共79页,编辑于2022年,星期一（四）浸润性

浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为,培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时,能浸润入其它组织细胞中,并有穿透人工隔膜生长的能力。

（五）异质性

所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多,增殖旺盛,中心区有的细胞衰老退化,有的处于周期阻滞状态,那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（StemCells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。

第55页,共79页,编辑于2022年,星期一（六）细胞遗传

大多数肿瘤细胞有遗传学改变,如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成,有干细胞系和数个亚系,并不断进行着适应性演变。

第56页,共79页,编辑于2022年,星期一(2)体外培养上皮细胞的形态学变化