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甜瓜T-DNA插入突变体的构建

许荣华;姜陆;宁雪飞;李冠

【摘要】[目的]构建激活标签载体并将其转入甜瓜中,获得甜瓜T-DNA插入突变体,

为甜瓜功能基因组学的研究奠定基础.[方法]用PCR法扩增目的DNA片段,经

EcoRI和SacI顺序酶切,将目的片段连接到pCAMBIA2301载体上,构建含4×35s

EnhancerDNA片段的激活标签载体.以甜瓜品种‘伽师’为材料,利用农杆菌介导

的转化体系转化甜瓜愈伤组织,获得甜瓜T-DNA插入突变体.[结果]获得4株T0代

甜瓜转化幼苗,通过Kan筛选和PCR鉴定甜瓜转化幼苗的DNA中是否含有目的基

因,证明其中3株甜瓜转化幼苗为转基因植株.[结论]获得了突变植株,为甜瓜重要性

状基因发掘奠定基础.

【期刊名称】《新疆农业科学》

【年(卷),期】2016(053)006

【总页数】6页(P1048-1053)

【关键词】甜瓜;激活标签;T-DNA插入突变体

【作者】许荣华;姜陆;宁雪飞;李冠

【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学

与技术学院,乌鲁木齐830046;新疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐830046;新

疆大学生命科学与技术学院,乌鲁木齐830046

【正文语种】中文

【中图分类】S652

【研究意义】甜瓜(CucumismeloL．)是全球的10大水果之一[1]，也是葫芦科基

因组学研究的模式种。新疆作为厚皮甜瓜的次生起源中心之一,甜瓜品种类型之多、

品质之佳、分布之广、栽培面积之大均居全国首位，有许多品质优良的甜瓜种质资

源,然而各品种均存在抗病性差、不耐弱光等问题[2]。尽管2012年甜瓜基因组测

序的完成获得了大量甜瓜基因组序列的数据[3]，但是DNA或者蛋白质本身不能

为基因的各项生物学功能提供足够的信息。研究基因功能最直接的方法之一是破坏

基因的表达并分析由此带来的表型变化。由于除了能破坏插入位点基因的表达，插

入的片段还能在分析突变体时用作分子标记，转座子和农杆菌T-DNA插入突变已

经成为最广泛应用的方法。由于T-DNA插入拷贝数低，平均每一个转化植株只含

1.5个拷贝，而且能在后代稳定遗传，农杆菌T-DNA插入突变已经成为研究功能

基因组学应用最广泛的方法大规模构建甜瓜突变体，对表型特异突变体进行筛选与

分析，明确相关基因的功能为甜瓜优良基因资源的利用奠定了基础。【前人研究进

展】1992年，Hayashi等[4]创造出来激活标签(Activationtagging)技术，构建

了带有四个串联花椰菜病毒35S启动子是增强子序列的T-DNA载体，转入植物

中获得基因过表达的突变体。激活标签技术在基因功能组学研究中发挥着重要的作

用，激活标签法构建突变体已应用到拟南芥[5]，水稻[6]，棉花[7],油菜[8]，番茄

[9],矮牵牛[10]等植物基因功能研究中,并取得较好成果。运用激活标签法,已从拟南

芥中分离出lep、sturdy等30多种新的基因,并对ft、myb、yucca等基因进行

了详细的功能研究。其中ft基因编码的蛋白产物是成花激素，是拟南芥诱导开花

途径中的重要基因；MYB转录因子基因编码的MYB转录因子参与植物次级代谢

过程，在木质部合成和分化过程中起重要调控作用；与生长素含量有关的yucca

基因编码黄素类单加氧酶，YUCCA酶是色胺途径中形成吲哚-3-乙醛肟的关键酶，

YUCCA基因过表达导致吲哚-3-乙醛肟过剩，生长素含量上升，表现为高激素显

性[11-15]。而且Tani等发现，拟南芥中的激活标签载体不仅可用于研究植物的生

长发育，也可用于发现抗病基因[16]。【本研究切人点】目前国内外主要采用

EMS化学诱变的方法获得甜瓜突变体,结合高通量测序的方法点突