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《分子生物学实验》

实验报告

实验名称:蛋白印迹技术

姓名:陈杰

学号:3140104666

序号:25

同组同学:唐陈曦

带教教师:刘伟俞萍

实验日期:2015年9月29日

目录

1、原理

1、1Westen印迹技术

1、2RT-PCR6

1、3聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(2D).

2、操作步骤

2、1安装垂直板型电泳装置

2、2凝胶的制备

2、3转膜

2、4封闭

2、5一抗反应

2、6洗涤

2、7二抗反应

2、8洗膜

2、9检测

3、实验结果

3、1照片记录

3、2数据处理

4、讨论

1、原理

1、1Westen印迹技术

蛋白质印迹技术又称免疫印迹技术与Western印迹技术(Westernblotting),就是鉴别

蛋白质的分子杂交技术。Westernblotting的原理就是将经过SDS分离的蛋白质样

品转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜、尼龙膜或PVDF膜)上,固相载体以非共价键形

式吸附蛋白质。且能保持电泳分离的蛋白质的相对位置不变(转膜装置与预染的标准相

对分子质量蛋白的转膜结果见图8-2-5～5-2-7)。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,

与对应的未标记的一抗起免疫反应,再与酶或同位素标记的二抗反应,经过底物显色、化

学发光或放射自显影,可以检测电泳分离的某种特定蛋白成分的存在与含量。该技术也广

泛应用于检测某种蛋白的表达水平。

Westernblotting实验过程主要有以下几个步骤:

1、SDS分离待检测的蛋白质;

2、转膜:将SDS分离的蛋白质转移到膜上;

3、封闭:即利用非反应活性物质封闭固相载体膜上未吸附结合蛋白质的区域;

4、抗体结合:即利用相应蛋白质的抗体(一抗)与待测蛋白质进行免疫结合,再与

酶或同位素标记的第二抗体起反应;

5、底物显色或放射自显影检测电泳分离的特异性目的蛋白的存在与否与含量。

Westernblotting的转膜方式以电转移最为常用,固相载体主要有:硝酸纤维素薄膜、尼龙

膜与聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)。硝酸纤维素薄膜结合蛋白的能力为100ug／cm2,综合性

能较好,以往使用的人较多;尼龙膜结合蛋白质的能力较强(480ug/cm2),有很高的灵敏度,

但结合背景较高;PVDF-膜具有较好的结合蛋白质的能力(200ug/cm2),且能较牢固地结合

蛋白质,该膜的机械性能与化学特性强,不易卷曲或撕裂,在90%甲醇的脱色条件下也不会

影响膜的结构,结合在膜上的蛋门质可以直接进行序列分析,具有较好的染色与检测的兼

容性。

常用的二抗标记物有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等,辣根过氧化物酶最敏

感的底物就是3,3’-二氨基联苯胺,它在过氧化物酶所在部位被反应转变成棕色沉淀。在

钴或镍离子存在下进行反应可以加深沉淀的颜色并提高反应的灵敏度。但就是,使用辣根

过氧化物酶不可能完全排除背景颜色,因此须十分小心地观察生色反应,一旦特异性染色

蛋白带清晰可见,就应尽快终止生色反应。碱性磷酸酶可催化底物5-溴-4-氯-3-引哚磷酸

／氮蓝四唑(BCIP/NBT)在原位转变为深蓝色化合物。这就是利用二抗标记物进行的显色

反应.就是最早的Westernblotting检测方法,现在主要用于免疫组化,在显微镜下观察。该

方法的灵敏度相对较低,可以检测ng水平的目标蛋白。ECL化学发光检测试剂就是基于

Luminol的新一代增强型化学发光底物试剂,它由辣根过氧化物酶(HRP)催化发生化学反

应,发出荧光,结果可以通过X光片压片与其她显影技术展现,或使用Luminometer检测。

溶液A主要成分为Luminol及特制发光增强剂,溶