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生化别离工程

复习

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n据各种资料统计，别离纯化过程所需的费用要占产品总本

钱的很大比例，按产品不同。

n对抗生素生产而言，别离纯化局部的投资费用约为发酵局

部的4倍；对有机酸或氨基酸生产而言，那么为1.5倍；对

基因工程药物，别离纯化技术的要求更高，如重组DNA蛋

白质精制的费用可占整个生产费用的80~90%；对于血液

制品，别离纯化几乎占整个生产费用的100%。

n因此人们逐渐认识到下游工程的落后有可能会阻碍生物技

术的开展。

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一、别离纯化的一般步骤

n(1)发酵液的预处理和固液别离；

n(2)初步别离(提取)；

n(3)高度纯化(精制)；

n(4)成品加工。

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二、多肽和蛋白质的纯化

n多肽和蛋白质的纯化包括两局部内容。

n一是将蛋白质与非蛋白质分开，二是将不同的蛋白质分开。

n对非蛋白局部可以根据其性质采用适当的方法去除。而对于不同蛋白

质的别离那么可以利用它们之间性质上的差异进行。常用的方法有:

n(一)利用溶解度不同的纯化方法有盐析法、有机溶剂法、等电点沉淀

法、加热变性法等。

n(二)利用分子形状和大小不同的纯化方法凝胶层析法、透析法等。

n(三)利用电离性质不同的纯化方法离子交换法、电泳法等。

n(四)利用生物功能专一性的不同纯化蛋白质亲和层析法等。

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三、蛋白质别离纯化举例

n3.1重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

n人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子〔human

macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CS〕是一种可由

体内多种细胞产生的细胞因子，如激活的T、B淋巴细胞、成

纤维细胞、内皮细胞等，可作用于造血干细胞，促进其增殖、

分化，形成中性粒细胞和巨噬细胞群，同时还能刺激噬酸性

粒细胞、巨核细胞、多浅能性和早期红细胞的形成和增殖。

n1993年获美国FDA批准重组GM-CS〔rhGM-CS

床。主要用于治疗肿瘤化疗产生的造血障碍、再生障碍性贫

血、骨髓异常增生综合征等，还用于增强免疫、骨髓移植等。

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3.1.1GM-CS的特性

n分泌到细胞外的成熟人由127个氨基酸残基组成，分子量

为22kD。

n不同来源的GM-CS分子量范围为14.5kD35kD，分子量

差异是由糖基化程度不同造成的。但糖基化程度不同的

GM-CS生物学活性却没有明显的不同，甚至有报道大肠

杆菌表达的非糖基化GM-CS比真核细胞表达的糖基化

GM-CS具有更高的生物学活性。

nGM-CS的分子由两个反向平行的折叠和四个反向平行

的螺旋组成，有两个二硫键分别连接螺旋B和折叠的第

二条链、螺旋C和羧基末端。

nrhGM-CS的pI为5.4。

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3.1.2GM-CSF的别离和纯化

n本例是以包涵体的形式进行表达的。

nI)．收集菌体细胞

n发酵后的工程菌以7000r/min离心30min，用50mmol/L

Tris-盐酸缓冲液反复洗涤、离心3次，去上清液。

nII)．细胞破碎与包涵体的收集

n沉淀〔菌体细胞〕加4