大肠杆菌感受态细胞的制备和转化.docVIP

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专业技能训练（分子生物学部分）

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

一、概述

在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。

转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：

1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。

4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

本实验以E.coliJM109菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

二、材料、设备及试剂

1.材料：E.coliJM109:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pQBI63质粒DNA；eppendorf管；冰块

2.设备：摇床培养箱、离心机、酒精灯、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪。

3.试剂：

1.LB固体和液体培养基

2.Amp（50mg/ml）

3.0.05mol/LCaCl2溶液

4.质粒DNA

5.2ml离心管

6.涂布棒、枪盒、培养皿

三、步骤

1、受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落,接种于5mlLB液体培养基中,37℃培养12小时至对数生长后期。以2%的比例接种于50mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2小时至OD600＝0.3-0.4，移至2ml的无菌离心管中。（实验已经备好）

2、感受态细胞的制备(CaCl2法)

1）将2ml装有培养液的离心管，冰上放置10分钟，然后于4℃下4000rpm离心10分钟。

2）弃上清,用预冷的0.05MCaCl21.2ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15min，4℃下4000r离心10min。

3）弃上清,加入200ul预冷的CaCl2,轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液，直

接用于转化实验。（暂时不用的感受态细胞贮存于-70℃可保存半年。）

转化

从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。

加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μl)5ul，轻轻摇匀，冰上放置30分钟。

42℃水浴中热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却5min。

向管中加入1mlLB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。

4℃下4000r离心10min，弃上清800ul后轻混，取菌液100μl涂布于含Amp的筛选平板（LB+）上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16小时。

对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DN