细胞因子检测方法.ppt

ELISPOT发展历史1963年：Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lyticplaqueformingcellassay,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。1983年：Czerkinsky等成功地检测出因受刺激而分泌抗体的B细胞频率接近体内实验的环境，藉由检测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者PrecursorT亚群的大小，预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。1996：俄亥俄卅CaseWesternReserve大学PaulLehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthuberetal.,Science,1996），解决了低敏感度的问题。Nordstrom等用生物素-抗生物素蛋白生物放大法来提高这种方法的敏感性Herr用计算机辅助图像分析系统(computer-assistedvideoimageanalysis,CVIA)自动分析TNF-α酶联免疫斑点的大小和数量,计算与负载抗原肽的靶细胞接触后PBMC中抗原特异性CD8+T细胞的数量Vaquerano等将数码相机和计算机结合起来,开发出类似的斑点计数系统,认为当每孔斑点数大于100时,这种方法更客观、可重复性高且节省时间第31页,共50页，星期六，2024年，5月第32页,共50页，星期六，2024年，5月检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过显微镜或ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。第33页,共50页，星期六，2024年，5月ELISPOT标准操作程序D1ELISPOT包被程序每孔加入15μl70%的乙醇预湿30秒，PVDF膜变成半透明状（加样注意！）加入100μl去离子水洗涤三次，尽量减少乙醇的残留每孔加入100μl包被抗体工作液，4°C包被过夜第34页,共50页，星期六，2024年，5月ELISPOT标准操作程序D2倾倒包被液，用PBS洗涤5次，最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干200μl试剂盒自带的稀释好的封闭液，37°C封闭1小时倾倒封闭液，无须洗涤，直接可以进行细胞培养。（也可以用PBS缓冲液或者纯水洗涤一次，拍干，封口，4°C保存，可以在4°C保存数周。）第35页,共50页，星期六，2024年，5月ELISPOT标准操作程序D2铺细胞,加入刺激物，培养正对照（PHA刺激）10μl，终浓度4ug/mL样品负对照（不加刺激物）背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）：100μl的U-Cytech无血清培养基设置2-4个孔的重复第36页,共50页，星期六，2024年，5月ELISPOT标准操作程序D2以前做的封闭，可加入200μl的U-Cytech无血清培养基，室温静置10分钟，倾倒，然后再重复一次加入不同浓度的细胞，100μl/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀加入刺激物（配制成10X终浓度，10μl/well）到实验孔不要再震动或者拍击ELISPOT板盖上板盖，放入二氧化碳培养箱，37°C培养18-24hr在整个培养过程中避免移动、碰撞培养板。避免开关培养箱的箱门！第37页,共50页，星期六，2024年，5月ELISPOT标准操作程序D3培养后操作倾倒孔内的细胞及培养基，低渗法将细胞裂解：每孔加200μl冰冷的去离子水，将板置于冰上冰浴10分钟200μl的PBST洗涤10遍，洗涤最后一遍之后，将板倒扣在吸水纸上拍干稀释检测抗体，每孔加入100μL生物素标记的检测抗体，37°C1小时200μl的PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干第38页,共50页，星期六，2024年，5月ELISPOT标准操作程序D3在一个浅托盘中盛上干净的PBST，将膜板的底面浸入，轻轻摇晃几次即可。（注意：一定要将膜的背面和塑料保护层上的液体甩干之后，再合拢，盖上，不要伤害到膜！）第39页,共50页，星期六，2024年，5月ELISPOT标准操作程序D3稀释酶标的链霉亲和素，每孔加入100μl，37°C1小时200μl的PBST洗涤5遍，洗涤最后一遍时，将PVDF膜板的背面的塑料保护层取下，同时洗涤膜的正反两面，盖上保护层，将板倒扣在吸水纸上拍干解冻已配好的显色液，每孔加入100μl的显色液，室温静置20