细胞工程植物组织器官培养技术.ppt

****MS高盐平衡培养基N6,B5高硝态氮培养基Nitsch中盐培养基**细胞分裂素类：BA—6-benzyladenineKT—kinetinZeatin生长素类：NAA—naphthaleneaceticacidIAA—indole-3-aceticacid2,4-D—2,4-dichlorophenoxyaceticacid2,4**花药培养一般在24～28℃，光照1000～2000lx，光周期14h的条件下进行培养。40瓦日光灯，离1.8～1.4米时，相当于25～50lx。**在培养基中加入活性炭，有利于花粉胚状体或愈伤组织的发生，从而提高花粉植株的诱导率。在烟草、马铃薯、玉米、油菜、小麦和黑麦等植物的花药培养基中，加入0.5%-1.0%的活性炭可以有效地提高花粉植株的数量。活性炭的作用可能是吸附了琼脂中不利于花粉细胞生长的某些杂质，同时也可以吸附各种植物激素从而调节内源和外源生长物质的水平等。**液体培养液层0.5mm左右，可以加入一些Ficoll作为漂浮剂，使花药全部不下沉而漂浮在液面上，这样通气良好，提高了培养效果，要注意及时转移沉于瓶底部的长大的愈伤组织，否则会影响再分化培养的效果

液体培养具有一定的优越性：

在液体培养中不存在位置效应；可以在培养过程中补加新鲜培养基和重新调整培养基的成分；液体培养有利于花粉粒的释放及分裂形成愈伤组织

但如何掌握转分化的时期等细微环节直接影响到花药培养的效果

聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。********Nitsch(1970)在南洋金花中观察到4核花粉发育成胚状体；Nemec在风信子中发现，有些小孢子核连续分裂3次，形成类似8核胚囊的现象，称为花粉胚囊。在异种花粉或物理化学因素诱导下，卵细胞未经受精启动细胞分裂产生单倍体胚叫做孤雌生殖(parthenogenesis)。****看护培养：这一方法是Sharp于1972年在番茄花粉培养中创建的，具体做法是：－取适宜发育时期的蕾消毒，取出花药，分离小孢子并将其密度调整到20个/ml；－在配好的半固体培养基表面横放几个（4个）完整花药，在其上平放上灭菌的滤纸片；－取0.5ml花粉悬液接种于滤纸片上；－将接种的花粉悬液置于适宜条件下培养（一个月可长出绿色细胞团）**与其他器官的培养技术相比，花粉粒培养还不成熟，影响培养的效果可能很多，要非常系统归纳还不可能，简述：

A、在培养前分离的花药应多次洗涤，否则其生长和形态发生将受影响，不洗涤的花粉不能生长或只能形成愈伤组织

B、冷处理已广泛用来提高花粉雄核发育的频率

C、培养基中增加蔗糖和肌醇的浓度能明显提高雄核发育的频率。

****继代培养得到足够的检测苗、进行病毒检测。**每种病毒都有自己敏感的植物，例如：

马铃薯病毒的敏感植物有千日红、黄花烟、心叶烟、毛叶曼佗罗

大丽花病毒的敏感植物为：矮牵牛、黄瓜、苋色蓠

菊花病毒：矮牵牛、豇豆

**血清学反应是指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。血清学反应的一般特点：1、抗原抗体的结合具有特异性，但有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。2、抗原抗体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。3、抗原抗体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。4、血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原抗体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原抗体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。**液相内沉淀试验凝胶内沉淀试验**缺点：需制备高质量的抗血清；免疫反应物消耗量大；抗体/抗原被酶连板吸附后与抗原/抗体的结合力下降**1将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体；2加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。3洗涤，洗去游离抗原；加酶标抗