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中药蛋白酶抑制剂的筛选及防治急性肺损伤作用研究

蛋白酶抑制剂(PI)广泛存在于动植物和微生物中,在体内能抑制蛋白水解酶

活性,在许多疾病及病理过程中有控制作用,如与炎症、血液凝固、补体级联反应、

细胞调亡、激素调节等;现代药理研究表明鱼腥草具有增强机体免疫、抗病毒和

抑癌等作用,临床主要用于治疗呼吸系统疾病如治疗肺痈吐脓、痰热喘咳,肺及气

管病变(气管炎、肺炎、支气管扩张、百日咳)。急性肺损伤(ALI)是急性呼吸窘

迫综合征(ARDS)或多脏器功能衰竭(MOF)的早期阶段,是指由各种肺内、外致病因

素导致的急性进行性缺氧性呼吸衰竭。

ALI的发病率和死亡率很高,在美国每年大约有10万人发生ARDS,其病死率

高达50～70%,是临床上常见的死亡率极高的危重症之一,是目前医学界研究的

一个热点。为在中药中寻找出安全有效的植物源蛋白酶抑制剂,并探讨其作用和

机理,本研究对60种中药蛋白酶抑制剂的活性进行了筛选,并对鱼腥草蛋白酶抑

制剂组分防治急性肺损伤的作用和机理进行了研究,以期为临床用药提供科学依

据。

本论文的主要研究内容和结果如下:1具有蛋白酶抑制剂活性的中药筛选本

实验以胰蛋白酶为底物,以大豆胰蛋白酶抑制剂为对照,对临床应用较广的60种

中药配方颗粒,大黄、鱼腥草、麻黄、白芍、瓜蒌皮5种药材的水、乙醇提取物

的体外蛋白酶的抑制作用以及这5种中药的水提取物进入体内的蛋白酶抑制剂

活性进行了研究。研究结果显示:(1)蛋白酶抑制剂活性较强的中药集中在发散风

寒药及清热解毒药中。

60种中药配方颗粒中有13种中药在100mg·mL-1时蛋白酶抑制作用较强,

依次为三七、麻黄、大黄、白芍、鱼腥草等;有9种中药在50mg·mL-1浓度下蛋

白酶抑制作用较强,依次为茯苓、大黄、山豆根、麻黄、白芍、鱼腥草、连翘等;

其中麻黄、大黄、鱼腥草、白芍、连翘5种中药在上述两浓度下均表现出蛋白酶

抑制作用。(2)大黄、鱼腥草水提取液,麻黄、白芍的70%乙醇提取液的体外蛋白

酶的抑制作用较强。

大黄、鱼腥草、麻黄3种中药水提取液和70%乙醇提取液均有较强的蛋白酶

抑制作用,瓜蒌皮的蛋白酶抑制作用不明显。(3)大黄、鱼腥草、麻黄、白芍、瓜

蒌皮水提取物大鼠灌胃给药,大黄、鱼腥草的含药血浆对胰蛋白酶的抑制作用较

强,瓜蒌皮水提取物对胰蛋白酶的抑制作用不明显。

2鱼腥草蛋白酶抑制剂组分的分离本实验采用正交试验的方法,考查了影响

鱼腥草水提取物蛋白酶抑制活性的因素,确定了最佳提取条件为60℃,加30倍量

水,在pH9下煎煮3h,并以此条件对鱼腥草进行提取,水提液减压浓缩,离心除去

沉淀,上清液氯仿萃取,水层过滤除去沉淀后过大孔树脂,分别用水、

30%,50%,70%,95%乙醇洗脱大孔树脂,得组分1、2、3、4、5。氯仿层过离子交换

树脂,氨水洗脱,得组分6。

经试管法和薄层色谱法定性鉴别,组分1为多糖和苷类物质,组分2、3、4、

5为黄酮类物质、组分6为生物碱。测定各组分对蛋白酶活性的抑制,结果表明:

蛋白酶抑制剂活性最强的为组分6(生物碱),其次是组分1(多糖类)和组分2、3、

4、5(黄酮类)。

3鱼腥草蛋白酶抑制剂防治LPS诱导的大鼠急性肺损伤实验研究本实验采用

LPS诱导的大鼠急性肺损伤(ALI)模型,研究鱼腥草蛋白酶抑制剂对ALI的防治作

用。结果显示:鱼腥草蛋白酶抑制剂能减轻LPS诱导的急性肺损伤大鼠肺间质增

厚,减少肺间质和肺泡腔内出血、水肿及渗出物,降低肺间质中胶原纤维含量,减

轻肺组织纤维性增生,改善肺损伤症状;鱼腥草蛋白酶抑制剂能显著降低ALI大

鼠肺泡灌洗液中MDA含量及血清中IL-6、IL-8及TNF-α水平;有显著降低ALI

大鼠肺组织中HYP含量的趋势;显著下调ALI大鼠肺组织中MMP-2、MMP-9的含量

和蛋白质表达。

说明鱼腥草蛋白酶抑制剂对ALI有一定的防治作用,其作用的机理可能是阻

止了急性肺损伤的早期阶段脂质过氧化过程,通过减少氧自由基和炎性因子的释

放,降低MMPs的活性,减少肺组织的损伤。4基因芯片技术研究鱼腥草蛋白酶抑

制剂对A549细胞基因表达谱的影响本实验采用肺泡上皮来源的A549癌细胞株替

代肺泡Ⅱ型上皮细胞,用基因芯片技术检测了鱼腥草蛋白酶抑制剂对A549细胞

基因表达谱的影响。

结果表明:有明显差异表达的基因共有204