细胞电生理研究进展.ppt

参与维持细胞正常形态第31页,共45页，星期六，2024年，5月细胞兴奋-收缩偶联第32页,共45页，星期六，2024年，5月细胞兴奋-分泌-兴奋偶联第33页,共45页，星期六，2024年，5月细胞跨膜信号转导第34页,共45页，星期六，2024年，5月3.2离子通道——分类第35页,共45页，星期六，2024年，5月在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性，即细胞静息电位的钾离子学说；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪30—50年代做出了开创性研究。他们基于电压钳技术，提出并验证了所谓的Hodgkin—Huxley方程，数学模拟出和真实状况相符合的神经冲动的传导，由此建立了细胞动作电位的钠离子学说。离子通道的近代观念也由此产生。3.3离子通道研究理论第36页,共45页，星期六，2024年，5月3.4离子通道研究技术微电极电压钳-电流钳技术传统膜片钳技术ErwinNeher(1944-)KennethCole(1900-1984)第37页,共45页，星期六，2024年，5月3.平板膜片钳技术（膜片钳技术新趋势的关键）原创技术专利：第38页,共45页，星期六，2024年，5月表2.膜片钳技术的历史角色第39页,共45页，星期六，2024年，5月3.5传统膜片钳设备的组成电学部分信号放大器数据采集卡PC周边设备控制器等光学部分：荧光显微镜CCD照相机监视器激光器等机械部分防震台，气压泵或气瓶高精密微电极操作器灌流操作器显微镜移动平台或可移动载物台辅助部分：信号屏蔽罩微电极拉制仪药物灌流设备温度控制器第40页,共45页，星期六，2024年，5月3.6全自动膜片钳设备的组成工作站平板芯片+即：德国Nanion公司Patchliner德国Nanion公司Syncropatch96美国MolecularDevices公司Ionworks第41页,共45页，星期六，2024年，5月3.7不同膜片钳技术的比较1记录模式传统膜片钳平板膜片钳第42页,共45页，星期六，2024年，5月传统膜片钳高信息量：通道功能的各项指标、结合其他实验记录高灵敏度：pA级、单通道水平适用范围广：不受样本种类限制操作过程复杂，对实验者要求高实验数据量低，难以应用于药物筛选全自动膜片钳操作自动化，简单培训即可使用高效率、高通量实现某些传统膜片钳不具有的功能，例如全细胞模式内液灌流。保持传统膜片钳高信息量和高灵敏度方面程度不一，样本兼容性不一2各自的优缺点第43页,共45页，星期六，2024年，5月离子通道研究■通道蛋白分离、通道重建和基因重组技术

利用与通道特异结合的毒剂标记，可把通道蛋白质从膜上分离下来，经过纯化，可以测定各亚单位多肽的分子量。然后，把它们加入人工膜，可重新恢复通道功能。用于确定蛋白质氨基酸序列的基因重组技术的程序是：从细胞中分离出含有与该种通道蛋白相关的mRNA，置入某种细胞(如大肠杆菌)，经逆转录得到cDNA。用限制性内切酶将cDNA切割成特定片段，再用核酸杂交方法钓出特定的DNA并克隆化。通过测定阳性克隆DNA的核苷酸顺序，推断出相应的蛋白质氨基酸序列。第44页,共45页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第45页,共45页，星期六，2024年，5月**第二个电路图什么意思？**加膜片钳动画**加膜片钳动画**为什么要用膜片钳？（1）电压钳位（2）小片膜可测单个离子通道的电流防效应管运算放大器的正负输入端子为等电位，向正输入端子施加指令电位、经过短略负端子可以使膜片等电位，达到电位钳制的目的。当膜片微电极尖端与膜片之间形成10G欧（以上封接时．其间的分流电流达到最小，横跨膜片的电流（I）可100％做为来自膜片电极的记录电流（Ip｝而被测量出来。**加动画**加动画**添加各个功能的示意图片***在1939年进行的高频交变电流测量实验表明，当动作电位被触发时，虽然细胞的膜电导大为增加，但膜电容却只略有下降，这个事实表明膜学说所宣称的膜破裂的观点是不可靠的。***强调：电压钳是细胞电生理的时代标记，膜片钳是分子电生理的时代标记*关