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猪β干扰素的基因改造与酵母分泌表达

GeneModificationandSecretiveExpressingofPorcineIFN-β

InYeastPichiaPastoris

一、DNA抽提

取猪（杜长大三元杂）肝脏100mg于匀浆器中，加入500μlDNA抽提裂解缓冲液Ⅰ后充分研磨，

倒入EP管，再加1μl蛋白酶K（20mg/ml），56℃水浴4小时，煮沸5min灭活蛋白酶K，冰浴5min。

加入等体积酚-氯仿，旋涡振荡1min使之充分混匀后静置10min，12,000g离心10min，取上清，

重复加酚-氯仿抽提，离心后取上清，再于上清液中加入等体积异丙醇，旋涡混匀，静置10min后

12,000g离心10min。弃上清，加入1ml75%乙醇，7，500g离心10min。弃酒精，真空干燥5min，加

入50μl双蒸水溶解所抽提DNA。

二、PCR扩增及基因定点突变

模板DNA5μl

10xPCRbuffer5μl

dNTP4μl

BlenTaq0.5μl

引物1(IFNPM1)1μl

引物2(IFNPM2)1μl

HO33.5μl

2

50μl

94℃2min;94℃30s,55℃30s,72℃40s;30cycles;72℃10min。

PCR产物的回收纯化，按OMEGADNA纯化试剂盒进行。

1

纯化产物进行XbaI和ECoRI双酶切

体系：

17

IFN-β/IFN-βser6μl

10XBufferM2μl

XbaI1μl

ECoRI1μl

ddHO10μl

2

Total：20μl

37℃3h

扩大酶切体系，胶回收纯化酶切产物－20℃保存备用

三、pPICzαC质粒的抽提

1.钩取菌种划线于含25μg/mlZeocin低盐LB平板，37℃过夜培养。

2.挑单菌落于含25μg/mlZeocin低盐LB试管，37℃过夜振荡培养。

3.抽提质粒（采用OMEGA质粒抽提试剂盒）。

4.用ECoRI、XbaI酶切，电泳检测。

体系：

pPICzαC10μl

10XBufferM2μl

XbaI1μl

ECoRI1μl

ddH2O6μl

Total20μl

5.扩大酶切体系，胶回收纯化双酶切产物，－20℃保存备用

2

四、IFN-βser17与pPICzαC的连接

体系：

IFN-βser17