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猪β干扰素的基因改造与酵母分泌表达

GeneModificationandSecretiveExpressingofPorcineIFN-β

InYeastPichiaPastoris

一、DNA抽提

取猪(杜长大三元杂)肝脏100mg于匀浆器中,加入500μlDNA抽提裂解缓冲液Ⅰ后充分研磨,

倒入EP管,再加1μl蛋白酶K(20mg/ml),56℃水浴4小时,煮沸5min灭活蛋白酶K,冰浴5min。

加入等体积酚-氯仿,旋涡振荡1min使之充分混匀后静置10min,12,000g离心10min,取上清,

重复加酚-氯仿抽提,离心后取上清,再于上清液中加入等体积异丙醇,旋涡混匀,静置10min后

12,000g离心10min。弃上清,加入1ml75%乙醇,7,500g离心10min。弃酒精,真空干燥5min,加

入50μl双蒸水溶解所抽提DNA。

二、PCR扩增及基因定点突变

模板DNA5μl

10xPCRbuffer5μl

dNTP4μl

BlenTaq0.5μl

引物1(IFNPM1)1μl

引物2(IFNPM2)1μl

HO33.5μl

2

50μl

94℃2min;94℃30s,55℃30s,72℃40s;30cycles;72℃10min。

PCR产物的回收纯化,按OMEGADNA纯化试剂盒进行。

1

纯化产物进行XbaI和ECoRI双酶切

体系:

17

IFN-β/IFN-βser6μl

10XBufferM2μl

XbaI1μl

ECoRI1μl

ddHO10μl

2

Total:20μl

37℃3h

扩大酶切体系,胶回收纯化酶切产物-20℃保存备用

三、pPICzαC质粒的抽提

1.钩取菌种划线于含25μg/mlZeocin低盐LB平板,37℃过夜培养。

2.挑单菌落于含25μg/mlZeocin低盐LB试管,37℃过夜振荡培养。

3.抽提质粒(采用OMEGA质粒抽提试剂盒)。

4.用ECoRI、XbaI酶切,电泳检测。

体系:

pPICzαC10μl

10XBufferM2μl

XbaI1μl

ECoRI1μl

ddH2O6μl

Total20μl

5.扩大酶切体系,胶回收纯化双酶切产物,-20℃保存备用

2

四、IFN-βser17与pPICzαC的连接

体系:

IFN-βser17

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