细胞迁移和侵袭实验技术.ppt

微孔小室中的趋化实验微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。滤膜（聚碳酸脂膜）将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。第15页,共35页，星期六，2024年，5月第16页,共35页，星期六，2024年，5月BoydenChamber装置第17页,共35页，星期六，2024年，5月第18页,共35页，星期六，2024年，5月实验步骤1.在冰盒内将趋化因子由高浓度向低浓度稀释，将不同浓度的趋化因子置于趋化小室的下室，30ml/孔，每个浓度加3个孔，其中只加BM的孔为阴性对照；2.取对数生长期细胞，0.1%BM重悬细胞，调整细胞浓度为5×105/ml；3.加样：下室加不同浓度的趋化因子，将膜轻轻对折后展平，光面朝下毛面朝上，依次盖上胶垫和上室将螺丝对称拧上拧紧;在上室中加入细胞，50ml/孔，每个浓度加3个孔；第19页,共35页，星期六，2024年，5月实验步骤4.将趋化小室在37℃，5%CO2的孵化箱中孵育3h；5.在膜的两端加上夹子，毛面在PBS液面上蘸取，光面禁止碰到液体。毛面在架子上摩擦，再蘸取PBS，反复3次后再蘸取一次，晾干；6.固定,染色第20页,共35页，星期六，2024年，5月实验步骤7.取载玻片，剪角放在右上角，滴一滴石蜡，盖玻片封片；8.显微镜观察计数，每孔至少3个随机视野，3个孔的数值取平均值;作柱状图，纵轴趋化指数或细胞数，横轴组别；9.趋化指数(ChemotaxisIndex)=随着趋化诱导因子的浓度梯度而迁移的细胞数目/用培养基做对照的迁移细胞数目第21页,共35页，星期六，2024年，5月注意事项1.膜，胶垫，上下小室之间防止有气泡产生；2.放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。3.枪垂直，枪尖伸入孔中下大概4/5处，迅速加样，不要迟疑，打出液体的过程枪逐渐抬起，液体全部打出时枪尖离开液面。4.洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。第22页,共35页，星期六，2024年，5月第23页,共35页，星期六，2024年，5月第24页,共35页，星期六，2024年，5月第25页,共35页，星期六，2024年，5月第26页,共35页，星期六，2024年，5月肿瘤细胞侵袭试验MatrigelInvassionAssayTranswell系统Transwell小室0.4um孔径聚碳酯膜的扫描电镜第27页,共35页，星期六，2024年，5月原理人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃时是液体，在37℃会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。第28页,共35页，星期六，2024年，5月滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。原理Transwell电镜图片第29页,共35页，星期六，2024年，5月实验步骤及注意事项1.无菌条件下Matrigel于冰浴融化，用PBS（或DMEMonly培养基）稀释成1mg/ml浓度，-20°C冻存备用；2.取出已稀释好的Matrigel，冰浴融化，以50ml的体积铺于Tramwell小室（24孔板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），37°C放置lh，使Matrigel聚合成凝胶（注意：加基质胶时最好将24孔板放置在冰盒上，确保胶完全覆盖孔底，不要有气泡）；第30页,共35页，星期六，2024年，5月3.每孔加入200ml1640（或DMEM）培养基使胶重构；4.在Transwell下室中加入趋化因子或10%FBS培养基600ml/孔；5.在上室孔中准确加入细胞l×105个/孔，细胞悬液体积200ml，置于5%CO2培养箱于37°C培养24h（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）；6.待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；实验步骤及注意事项①Transwell小室②上层培养液③细胞④基质胶⑤下层培养液⑥细胞培养板T