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分子生物学实验的常见问题与解决方案

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一、Southern杂交

问题1:电泳后发现凝胶中DNA扩散,导致结果难以确定,如何解决这一问题？

解决方案:（1）在操作上:电泳时隔孔上样,电泳后要对凝胶及时处理使凝胶干燥；（2）琼脂糖的质量应该较好,尤其是不应含有内切酶,否则有时将使低拷贝数基因的杂交结果难以解释。

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问题2:传统方法中转膜不完全的问题如何克服？

解决方案:经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至24小时以上,也不能使大分子DNA良好地转移出去,因此,转膜不完全。向下转膜法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形；加之吸水纸的吸力与水受到的重力方向一致,故可以良好地完成DNA的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度较快,转移效率高。

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利用地高辛标记探针进行Southern杂交时,对于大于15kb的DNA片断,转膜之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率,但脱嘌呤过度可导致分子量相对较小的DNA被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。如果实验转膜过程中同时含有大于15kb的DNA(通常为基因组)和小片段DNA(通常是基因组酶切产物),那么在转移的过程中倾斜容器,仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸,这样既可以提高大片断DNA的转移效率,又不会打碎小片段DNA。

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另外,等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法,来解决这一难题:以转基因鼠的检测为例,实验步骤如下:1.转基因鼠的建立:以鼠乳清酸蛋白(WAP)基因5’调控区指导人G-CSF基因为构件,建立转基因小鼠。转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾DNA做Southern进行鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交:(l)用BanHI(150U)对由假孕鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg酶切过液,取少量电泳检查酶切完全后,上样电泳8小时,(2)将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3小时,用镊子轻轻揭起凝胶,放于变性液(0.5MNaOH,0.5MNaCl)20分钟,转置中和液(0.5MTrisHCl,0.15MNaCl)20分钟,将胶放于玻璃板上沥干液体,室温放置30分钟。(3)干胶应立即杂交。先将胶在水中泡一下,以利于操作。(4)将胶放人杂交液(6×SSC.5×Denhardt’S、0.25%SDS、100μg/ml鲑鱼精DNA),加人探针,42℃杂交16-20小时。(5)杂交完成后,洗膜8轮,42℃每次15分钟。2×SSC.0.1%SDS、1×SSC.0.1SDS、0.1×SSC.0.1%SDS、0.1×SSC.0.1%SDS、各洗两次,在冰水中浸泡2分钟,以利于盐的排出。(6)干燥后按检测试剂盒操作,室温压片0.5-2小时。冲片照相。使用的探针为G-CSF。DNA,探针标记采用Fluorescein-12-dUTP,检测试剂盒为杜邦公司产品,操作按试剂盒说明书进行。用琼脂糖凝胶直接杂交的方法,较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题,结果不仅直观,而且特异性好。与常规的Southern杂交相比,它所具有的优势是,它省略了将DNA进行转膜的步骤,从而避免了因转膜不完全所造成的DNA量的损失,特别是低拷贝数基因的丢失。另一方面,也使复杂的Southern杂交操作程序大大简化。因此,在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏检的一种可行途径。

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问题3:在向下转膜法中,如何提高转膜效率？

解决方案:1.转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高于凝胶,短时间内会有大量液体聚集在凝胶上,直接从侧面流失；果转移液的水平面过分低于凝胶,影响纱布的吸水力,转移效率下降。2.吸水纸吸水后易变形,使吸水纸与滤纸间产生空隙,而降低吸水纸的吸水效率,应及时更换吸水纸。3.过夜转移时,及时添加转移液,防吸干。4.样本丰度高时,移时间可以缩短至1小时,此时凝胶上仍可见大分子量DNA的残留,当样本丰度低时,以延长转移时间。5.纱布上不要加盖重物,防凝胶受压变薄,响转移效率。

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问题4碱转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存,且防止长期保存过程中DNA结合不紧密影响杂交效果,应如何做？

解决方案:将尼龙膜置于滤纸上干燥片刻,在紫外交联仪中将转有DNA的一面向上12000J交联4min,若尼龙膜暂不杂交,可在4℃下保存备用但存放时间不宜超过半年。

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问题5使用碱转移法,将导致杂交后探针的去除困难,几乎80%-90%的探针难以洗脱,如何解决这一问题？

解决方案:将煮沸