细胞培养基本技术全面知识普及.ppt

细胞的运送第125页,共138页，星期六，2024年，5月内容细胞培养的理论背景设备与器材准备、溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存、复苏与运送常见问题及对策第126页,共138页，星期六，2024年，5月污染：预防为主微生物污染的种类：细菌、酵母、霉菌、支原体等第127页,共138页，星期六，2024年，5月常见的污染途径工作区不洁液体溅出而未及时处理器皿试剂灭菌不彻底或灭菌后再污染，尤其是过滤除菌操作。血清污染谈话、咳嗽打喷嚏手或器械从打开的器皿口上方经过。手拿吸管的位置过低。瓶口溢出物洁净物触碰不洁物培养箱中其他瓶污染扩散第128页,共138页，星期六，2024年，5月微生物污染的表现 pH值突然改变培养基颜色改变、混浊镜检可见异常颗粒、菌丝琼脂平板培养可见菌落每次操作前均须留意培养基的变化！第129页,共138页，星期六，2024年，5月支原体污染细胞生长缓慢或死亡，悬浮细胞聚集。检测方法：PCR、ELISA、荧光染色等第130页,共138页，星期六，2024年，5月病毒污染很难检测一般对实验无影响第131页,共138页，星期六，2024年，5月预防措施定期清洁和消毒工作区及时处理溢出物和溅出物严格灭菌除菌程序严格无菌操作从可靠供应商购买试剂，尤其是血清。每人准备一套实验材料（器皿、溶液等）第132页,共138页，星期六，2024年，5月发生污染后的处理 弃去被污染的细胞，留意同时培养的其他细胞尽力排查可能被污染的环节彻底清洁消毒实验室弃去肯定或可能被污染的试剂，除非经证实绝对未被污染的。除非是特别珍贵的细胞，否则不建议采用高浓度抗菌药物处理培养物。第133页,共138页，星期六，2024年，5月抗生素的使用一般不建议使用，因为如下缺点：产生抗药性的菌株掩盖低水平、隐蔽性的污染掩盖了支原体感染产生抗代谢效应，影响哺乳动物细胞的生长。使无菌操作水平下降无法控制真菌、酵母的污染抗生素的应用仅限于原代培养、大规模培养或使用昂贵耗材的实验。即使使用抗生素，也应尽快停用。第134页,共138页，星期六，2024年，5月交叉污染：细胞污染细胞从声誉较好的细胞库获得细胞系。不要将有一个以上细胞系的培养瓶同时打开。应在其他培养操作之后，再处理迅速生长的细胞系如HeLa，或对它们单独操作。绝对不要对不同细胞系使用同一个吸管、同一瓶培养液及胰酶。不要将可能沾有细胞的吸管放入培养液瓶或胰酶瓶。首先加入培养液和其他试剂，然后再加入细胞。不要使用没塞棉花的吸管。经常检查细胞形态和相关特性。第135页,共138页，星期六，2024年，5月细胞库AmericanTypeCultureCollection(ATCC)http://www.ACTT.org中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中科院昆明细胞库/中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)/cctcc/第136页,共138页，星期六，2024年，5月Bible第137页,共138页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第138页,共138页，星期六，2024年，5月内容细胞培养的理论背景设备与器材准备、溶液配制无菌技术原代培养传代培养细胞计数与生长曲线冻存、复苏与运送常见问题及对策第93页,共138页，星期六，2024年，5月电子细胞计数器第94页,共138页，星期六，2024年，5月细胞计数板深度1mm，每个大方格是0.1mm3第95页,共138页，星期六，2024年，5月细胞计数操作制备单细胞悬液，吹打均匀后，转移一小部分样本（500ul）至1.5mlEP管中，加入等体积0.4％台盼蓝染液。75％酒精清洗计数板表面，注意不要划伤计数表面。将已染色待测细胞悬液吹打均匀，然后用移液器吸取20ul细胞悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，液体刚好流到计数板凹槽边缘。注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。将计数板平放在显微镜载物台上计数。第96页,共138页，星期六，2024年，5月第97页,共138页，星期六，2024年，5月统计角上四个大格的活细胞数。对于压线细胞的处理：数上不数下，数左不数右细胞团按照一个细胞计。结果计算：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数之和/4)×104×2

第98页,共138页，星期六，2024年，5月细胞计数的注意事项 制备单细胞悬液。不可有较多成团细胞。取样均匀。多次取样计数取平均值。细胞密度：每mm2细胞数100，一般1