CIK细胞制备SOP_原创精品文档.pdfVIP

CIK细胞制备操作SOP

一、样本接收

1.观察运输箱的温度是否符合要求，采血管或采血袋有无渗漏。

2.查看采血管或采血袋上客户信息是否与交接表一致。

3.样本外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收

记录，传入洁净区准备制备。

二、PBMC分离、接种

1.准备耗材试剂：离心管（50ml、15ml）、离心管架、移液管（25ml、

10ml）、包被好的T75、无尘布、EP管、枪头（1000uml）无菌棉球、封

口膜、肝素钠管、5ml注射器、50ml注射器针头、止血钳、废液缸（放

入安全柜中照紫外）、DPBS、75%酒精、生理盐水、淋巴细胞分离液、

血培养皿、CIK细胞培养基常温复温、CIK细胞诱导激活因子常温复温。

2.仪器设备准备及预热：电动移液枪、1000uml手动移液枪、生物安

全柜（照紫外30min、通风10min）、离心机开机、水浴锅37℃、全血分

析仪开机预热、倒置显微镜、热合仪开机预热（若样本通过采血袋运输）、

二氧化碳培养箱（37℃5%CO）。

2

3.提前包被T75瓶，2-8℃冰箱过夜或37℃培养箱不少于2H。包被

方法：使用25ml的移液管吸取19mlDPBS加入到T75瓶中，使用1000uml

的移液枪吸取包被因子（0.5mlLT-F-01、0.5mlLT-F-02）加入到该T75瓶

中，并吸取瓶中少许DPBS清洗装有因子的西林瓶，在将清洗液加入到

T75瓶中，然后从中吸取10ml包被液到另一T75瓶中，一同放入到2-8℃

冰箱过夜或37℃培养箱不少于2H。注意事项：①检查培养瓶的完整性，

检查培养瓶是否出现破损。

②包装袋中剩余培养瓶拧紧盖子，袋子重新密封。

③培养瓶避光暂存。

④包被液混匀充分，平铺在培养瓶的培养面上。

⑤不要将包被液碰到培养瓶盖上。

4.分离流程

1）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。

2）将样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、

DPBS、生理盐水、血培养皿、离心管架喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，

无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。50ml、15ml

离心管放到离心管架上。

3）用止血钳将采血管盖子打开，盖子倒放在台面上（尽量不要将血

滴到台面）。将50ml离心管盖拧开，盖子倒放在远离操作区的离心管架

上，使用25ml或10ml移液管将采血管中的血液平均分配到3-4个50ml

离心管中，并轻轻吹打混匀。取0.5ml样本滴加到血培养皿上，晃动留

一半空白做对照。取0.5ml血液样本到EP管中。盖上离心管的盖子注意

配平。打开离心机盖，放入到离心机中轴对称放置（配平）关上离心机

盖子，调整离心力800G,离心时间10min，升9降7（可提前将参数调整

好）点击开始。离心过程中，将EP管中的样本使用传染病检测板检测传

染病。将EP管中剩余的样本轻弹混匀，使用全血分析仪检测，可检测红

细胞、白细胞、淋巴细胞密度等相关数据。（离心过程可调整水浴锅参数

到56℃）（可在此离心过程中将分离液分装到离心管中，血细胞悬液与

分离液为2:1）

4）离心结束后，将离心管喷酒精平稳放入到安全柜中。拧开离心管

盖，倒放在远离操作区的离心管架上，打开新的离心管（对应相同的管

数），盖子同样倒放在远离操作区的离心管架上并依次排列（不要弄混），

使用10ml移液管将上层血浆转移到新的离心管中（注意不要取到下层的

血细胞）。用5ml注射器取少量的血浆到肝素钠管留样，送检到有资质的

检测机构检测传染病五项（乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、巨细胞）。盖上装

有血浆的离心管盖子，并使用封口膜封口。放入到56℃的水浴锅中，水

浴30min计时。

5）使用止血钳，将生理盐水拉扣打开，夹一团广口瓶中无菌棉球擦

拭生理盐水瓶口，将50ml注射器针头扎到盐水瓶口上。将盐水加入到第

三步取完上层血浆的离心管中，1:1混合下层血细胞。使用10ml移液管

吹打混匀血细胞悬液，并将其缓慢的加入到分离液管中。将其平稳放入

到离心机中，调整参数700G，20min升6降4。

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