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第二章基因工程与食品产业

基因工程：用人工的方法把不同的生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再将重组体引入宿主细胞或个体中以得到高速表达，最终获得人们所需要的基因产物。

基因工程操作的四个步骤：

一.在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体（质粒、病毒或噬菌体）

二.把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接成重组体

三．把重组体引入宿主细胞

四.筛选、鉴定出含外源目的基因的菌体或个体

基因工程载体：这种在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因进入宿主细胞的运载体。

限制性内切酶：能在特定部位限制性地切割DNA分子的酶。

在DNA重组技术中，限制性内切酶的主要用途：

在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性内切酶切割的DNA片段

建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱

构建基因文库

用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA

耐热DNA聚合酶：它具有依赖于聚合物5’-3’外切核酸酶活性，可用于：1.DNA测序2.聚合酶链式反映（PCR）对DNA片段进行体外扩增。

末端转移酶：催化作用不需要模板，可以给一些DNA分子的3’-OH末端接上

dA或dG，另些DNA分子的3’-OH末端接上dC或Dt,混合这些分子，可使同聚物尾部退火形成环状分子。

其主要作用：1.给载体或cDNA加上互补的同聚尾2.DNA片段3’末端的放射同位素标记。

碱性磷酸酯酶的主要作用：1.去除DNA和RNA的5’-磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用[ａ-32P]ATP进行末端标记，继而进行序列分析

2.去除载体DNA的5’磷酸基，防止自我环化，降低本底，提高重组DNA检出率。

理想基因工程载体的特征：

1．能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在外源DNA插入其DNA之后，仍保持稳定的复制状态和遗传特性。

2.易于从宿主细胞中分离，进行纯化。

3.在其DNA序列中有适当的限制性内切酶单一酶切位点。

4.具有能够直接观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。

目前常见的基因载体有细菌质粒载体、农杆菌质粒载体、入噬菌体载体、柯氏质粒载体和病毒载体等

质粒载体pBR322

其大小为4363bp，含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；还有单一的BamHI、HindIII和SalI的识别位点，这三个位点都在四环素抗性基因内。pBR322可以保证这个质粒只在大肠杆菌中行使复制功能。

PCR扩增法(利用多聚酶链式反应)

反应过程：1.变性：将模板DNA至于95摄氏度高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA

2.退火：使反应体系的温度降低至55摄氏度左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对

3.延伸：将反应体系温度升高到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72摄氏度，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。

一些改进的PCR扩增法：

逆转录PCR：以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。（构建CDNA的基础保证）

锚定PCR：特别适合于扩增那些只知道一段序列的DNA.克服序列未知或未全知的障碍（该法适用于mRNA扩增，而不适用于基因组DNA的扩增，此法可以克服序列未知或未全带来的障碍）

反向PCR:特别适合用于扩增已知序列两端的未知序列（用到2种酶）

核苷酸序列测定的方法：化学降解法、酶促法（双脱氧终止法）、自动测序法、PCR测序新方法等

酶促法：先将DNA分子用限制性内切酶切割成片段，然后用电泳依其长短不同分离，钝化单股片段，以32P标记其5’末端，并用以作为复制其互补片段的模板，在复制的过程中，利用从大肠杆菌提取的DNA聚合酶经过枯草杆菌蛋白酶处理而得的大片段，以复制互补单股DNA，从而求得其序列。

目的基因与载体的连接（重组与克隆）

黏性末端连接：共2种情况

1、同一限制酶切位点连接

2、不同限制酶切位点连接

平端连接

人工接头连接

同聚物加尾连接

重组体的筛选与外源基因的鉴定

重组体的鉴定

报告基因的检测法

目的基因分子的杂交检测方法

分子杂交技术：为了从分子水平鉴定目的基因是否已经整合到受体细胞中，是否转录，是否表达，经常用到基因探针杂交技术，即用已知基因片段（往往是目的基因片段）制作的探针，与待测样品的基因片段进行核酸分子杂交，从而判断两者的同源程度。

点杂交：将待测的DNA或RNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上，不需限制性内切酶进行酶切，即可与探针进行杂交反应。

Southernblot：目前被认为是