滇金丝猴检疫技术 第2部分：毛首线虫实验室检测技术规范.docxVIP

1

DB53/TXXXX—2021

滇金丝猴检疫技术

第2部分：毛首线虫实验室检测技术规范

1范围

本文件规定了滇金丝猴（Rhinopithecusbieti）检疫技术中毛首线虫实验室检测技术规范的试验原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品采集与保存、试验步骤、试验数据处理。

本文件适用于滇金丝猴检疫技术中毛首线虫实验室检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

线虫Nematodes

线虫动物门为假体腔动物，线虫属通常呈圆柱形，线状或毛发状，某些种类呈鞭状或球状。不分节，两侧对称并具有三胚层假体腔，一般为雌雄异体。虫体大小随种类不同差别较大，雄虫一般较雌虫为小。寄生性线虫最常见寄生于消化系统。

3.2

毛首线虫Trichuris

毛首线虫是滇金丝猴最为常见也危害最大的消化道线虫。虫卵随滇金丝猴粪便排到外界，在粪便和土壤中发育为感染性虫卵；经口感染后，幼虫在小肠内孵出，钻入肠绒毛间发育，然后移行到盲肠和结肠内发育为成虫。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PCR：聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction

TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液TrisAcetate-EDTABuffer

DNA：脱氧核糖核酸Deoxyribonucleicacid

NCBI：美国国家生物技术信息中心NationalCenterforBiotechnologyInformationBLAST：基于局部序列比对算法的有哪些信誉好的足球投注网站工具BasicLocalAlignmentSearchTool

GenBank：DNA序列数据库

2

DB53/TXXXX—2021

5试验原理

镜检滇金丝猴消化道内的毛首线虫虫卵或虫体，依据其形态特征鉴定病原；采用PCR方法开展分子鉴定。

6试验条件

6.1实验室通用要求

实验室应满足GB19489的要求。

6.2人员要求

采样与试验人员应为与动物保护相关的专业技术人员。

6.3生物安全要求

采样及试验过程中做好自身防护，试验结束后的检验器具要进行消毒处理，废弃样品要及时进行无害化集中处理。

7仪器设备和试剂

7.1主要仪器设备

7.1.1正置光学显微镜。

7.1.2载玻片及盖玻片若干，漏斗、玻璃棒、烧杯。

7.1.3金属筛：60目。

7.1.4PCR扩增仪。

7.1.5高速台式离心机。

7.1.6单道可调移液器（量程0.5μL～10μL、2μL～20μL、10μL～100μL和100μL～1000μL）。7.1.7电子天平（量程0.01mg～10000mg）。

7.1.8恒温水浴锅：36℃±1℃,65℃±1℃。

7.1.9超纯水器，高压灭菌器。

7.1.10电泳槽、电泳仪，紫外凝胶成像仪，涡旋振荡器。

7.2主要试剂

7.2.1饱和食盐水。

7.2.22.5%重铬酸钾液。

7.2.3基因组DNA提取试剂盒。

7.2.42×TaqPCRMasterMix酶。

7.2.5DL2000DNAMarker。

7.2.6无菌水。

7.2.750×TAE缓冲液：Tris碱242g和57.1mL冰醋酸，用双蒸水定容到1L。

7.2.8核酸染料，用于凝胶成像显示条带。

7.2.9琼脂糖，1%琼脂糖凝胶。1g琼脂糖与100mL1×TAE缓冲液，加热融化均匀，60℃时，倒入胶槽，插上样品梳。室温下待凝胶凝固后，垂直向上拔出固定在凝胶中的样品梳。

3

DB53/TXXXX—2021

8样品采集与保存

粪样的采集和保存方法见附录A。

9试验步骤

9.1形态学检测

9.1.1虫卵检测

采用饱和食盐水漂浮法，毛首线虫卵富集在饱和液表面。取粪样5g，加饱和食盐水50mL，用玻璃棒搅匀，通过60目金属筛或双层纱布过滤到干净烧杯中，静置0.5h；蘸取表面液膜，点样于载玻片上，盖上盖玻片，进行镜检。

9.1.2虫体检测

从粪样中分离虫体，用生理盐水清洗干净，放于载玻片，滴加乳酸酚透明液2～3滴，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察透明虫体的内部形态构造。对于存疑虫体，结合下述PCR扩增方法对其进行虫种鉴定。

9.2PCR检测

9.2.1DNA提取和保存