细胞的破碎与分离.ppt

*电声超声波发生器示意图第31页,共59页，星期六，2024年，5月*JY92-IID超声波细胞粉碎机第32页,共59页，星期六，2024年，5月*超声波法Ultrasonication其原理可能与空化现象(cavitationphenomena)引起的冲击波和剪切作用有关。空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。第33页,共59页，星期六，2024年，5月*超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活；超声波破碎的有效能量利用率极低；由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。第34页,共59页，星期六，2024年，5月*不同机械破碎方法的比较技术原理效果成本举例匀浆法(孔型)须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪切力而破碎剧烈适中细胞悬浮液大规模处理珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁珠捣碎剧烈便宜细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理超声波法用超声波的空穴作用使细胞破碎适中昂贵细胞悬浮液小规模处理第35页,共59页，星期六，2024年，5月*机械破碎法需要高能量，且产生高温和高剪切力，易使不稳定产品变性失活；破碎的有机体或释放的产物，不专一，并且产生碎片的尺寸范围大，后处理难度大；第36页,共59页，星期六，2024年，5月*2）非机械法I酶法溶胞EnzymaticLysis，酶解法，酶溶法利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎的目的。外加酶法自溶法第37页,共59页，星期六，2024年，5月*3.3非机械法外加酶法利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。第38页,共59页，星期六，2024年，5月*I外加酶法常用的溶酶溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等溶菌酶主要用于细菌类细胞壁溶解酶是几种酶的复合物第39页,共59页，星期六，2024年，5月*重要微生物细胞壁的降解酶第40页,共59页，星期六，2024年，5月*外加酶法溶菌酶能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的β-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶;酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等;植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。第41页,共59页，星期六，2024年，5月*外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。第42页,共59页，星期六，2024年，5月*外加酶法优点：产品释放的选择性高；抽提的速率和收率高；产品的破坏最少；对pH值和温度等外界条件要求低；不残留细胞碎片。费用高，通用性差。适用性：小规模的实验室研究。第43页,共59页，星期六，2024年，5月*酶法溶胞自溶法Autolysis自溶作用是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去。改变微生物的环境，可诱发产生过剩的这种酶或激发产生其他的自溶酶，以达到自溶目的。影响因素温度时间pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。第44页,共59页，星期六，2024年，5月*II化学渗透法Chemicalpermeation化学法用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分的方法化学渗透法某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。该法取决于化学试剂的类型以及