Realtime-PCR溶解曲线分析.docxVIP

首先我们得来说说染料法SYBRGreen的原理，SYBRGreen能够结合在双链DNA上面的荧光染料，只有结合了双链DNA，才会发荧光，而游离的不会发光。

图1SYBRGreen原理

但是，染料没有选择特异性，就是只要有双链DNA，就会染上，并发荧光。

如果使用的引物产生了非特异性扩增，那么荧光强度就不是目的条带真实的强度，因此会产生严重偏差。融解曲线我们如何判断本次qPCR扩增的都是目的片段呢？这就需要用到融解曲线。在qPCR循环反应结束之后，系统会进行测定融解曲线，通常的方式就是从70度加热到90度，然后每隔一定时间（1s或者少于1s）测定系统荧光强度，随着温度的升高，dsDNA都解开双链，SYBRGreen都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线：

图2融解曲线

然后我们运用医学中学到的高等数学C的求导，把荧光强度对温度求导，得出下图

图3融解曲线的求导

为什么中间的峰那么高？dR/dT越大，表明荧光值变化最快。随着温度上升，达到图中Tm点时，大部分扩增出来的双链DNA解开，荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异那么，融解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关)。但是除了单峰还会出现什么样的情况呢？请看下面两个示意图

图4前置杂峰

图5后置杂峰