western blot实验技术及常见问题探讨-珍藏版.pptVIP

酸解吸:仪器和溶液:解吸液:25mM甘氨酸-HCl，1%（w/v）SDS；pH2，磷酸盐缓冲液（PBS）:10mM磷酸钠，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl。浅托盘，大小足以将膜放入其中。操作:1.将印迹膜放入解吸液中振摇30分钟。2.将印迹膜放入缓冲液中振摇10分钟。用新缓冲液重复漂洗。3.继续下一轮检测的封闭步骤。目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。1WesternBlot结果分析软件Gel-ProAnalyzer4绿色版（附动画演示教程）/thread-44929-1-1.html2WesternBlot结果分析内参即是内部参照,对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白,它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在WesternBlot中使用内参其实就是在过程中另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量,上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个WesternBlot显色或者发光体系是否正常。常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为:阳性对照（最好有标准品（比如β-actin，GAPDH）或阳性血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）。成功进行WesternBlot检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WesternBlot的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；二抗对照:不加一抗，用于检测二抗的特异性；内参对照:检测标本的质量和二抗系统；空白对照:不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。WesternBlot常见问题探讨1SDS电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀,使其充分混合,防止部分胶块聚合不均匀温度合适,受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀,灌胶时候尽量混合均匀,动作轻缓拔梳子要迅速,清洗加样孔要小心,以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一,纯化样品,调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果,应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适2转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄,“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。转膜过程注意降温3转移到膜上的蛋白很少蛋白分子量10KD蛋白的等电点9SDS浓度不合适凝胶太厚原因对策蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜更换高pH值Buffer在阴极buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高转膜效率延长转膜时间膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度4背景太高5杂交信号很弱抗体保存不当抗原不充足膜的漂洗过度原因对策抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照减少漂洗的时间和次数一抗不是唯一特异的二抗出现非特异结合原因对策制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合6