细胞培养的基本方法.ppt

三.污染的预防防止污染，预防是关键。1）、培养操作前的准备超净台保持清洁；使用消毒后的器皿。第63页,共67页，星期六，2024年，5月2）、培养操作时的注意事项见无菌操作的注意事项。第64页,共67页，星期六，2024年，5月四、污染的排除1、使用抗生素；2、加温处理；3、动物体内接种除菌法；4、巨噬细胞吞噬法第65页,共67页，星期六，2024年，5月思考题1、细胞培养时如何预防污染？2、列举无菌操作的注意事项。第66页,共67页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第67页,共67页，星期六，2024年，5月六、培养细胞的取材取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。常用方法有机械法和化学法。第31页,共67页，星期六，2024年，5月第二节培养细胞的观察第32页,共67页，星期六，2024年，5月组织块培养法将组织剪成小块后，接种于培养瓶，24小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。培养瓶底预先涂以胶原薄层，以利上皮细胞的生长。如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡第33页,共67页，星期六，2024年，5月消化培养法采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。第34页,共67页，星期六，2024年，5月密度抑制（Densityinhibition）或接触抑制（Ccontactinhibition）1958年Abercrombie等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。第35页,共67页，星期六，2024年，5月培养细胞的生长过程1）原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般1-4周。第36页,共67页，星期六，2024年，5月2）传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisis）有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。第37页,共67页，星期六，2024年，5月（3）衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。表皮细胞寿命4-10天；红细胞3周-3个月，白细胞5-7天，神经细胞数年或更多。第38页,共67页，星期六，2024年，5月第39页,共67页，星期六，2024年，5月第40页,共67页，星期六，2024年，5月第41页,共67页，星期六，2024年，5月第42页,共67页，星期六，2024年，5月第43页,共67页，星期六，2024年，5月实体显微镜（解剖镜）倒置显微镜生物显微镜照相设备对培养材料进行细胞学鉴定和研究2、显微镜观察第44页,共67页，星期六，2024年，5月第45页,共67页，星期六，2024年，5月3、细胞计数法（cellcounting）用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。第46页,共67页，星期六，2024年，5月4、细胞生长曲线（cellgrowthcurve）是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。横坐标为培养时间纵坐标为细胞密度注意：只有具备自身稳定生长特性的细