组织化学技术酶组化.ppt

0.3％H2O20.1mlGraham—K孵育液：DAB4HCL5mg0.05MT—H缓冲液（PH7.6）10ml1％H2O210mlLojda孵育液：0.1％N—苯基—对—次甲苯二胺25ml0.1％α--萘酚25ml0.3％H2O2（新配）1ml第31页,共34页，星期六，2024年，5月〔方法〕①固定：温度4℃，30分钟（3％戊二醛固定液：20％戊二醛15ml，或25％戊二醛12ml0.2M磷酸缓冲液50ml，蒸馏水加至100ml止）；②洗涤：洗涤三次以上，每次15分钟，或过滤。③切片：Cryostat制成切片（5～10μm）[染色步骤]①切片入下列孵育液中第32页,共34页，星期六，2024年，5月a．预孵液：室温下10～30分钟b．后孵液：Fahimi孵育液，室温5～60分钟Gropam--Karnovsky液，室温，3~10分钟②洗涤：蒸馏水漂洗③染核：亚甲蓝染核④封固：甘油明胶封固▲髓性过氧化物酶显示法。①固定与切片：用冷的2.5％戊二醛固定30～60分钟，然后用Cryostat制成20微米切片。第33页,共34页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第34页,共34页，星期六，2024年，5月*07/16/96*##关于组织化学技术酶组化*1※特点：①在原位检测②检测酶的活性而不是酶分子本身酶的分类：按生物化学分类——六大类①氧化还原酶②转移酶③水解酶④裂解酶⑤异构酶⑥连接酶常用检测方法1．沉淀法①金属沉淀法：Ca++—Co++法；Pb法②偶联法：重氮盐法③靛原法④四唑盐法第2页,共34页，星期六，2024年，5月22．后偶联法Post-coupling（ACP）3．合成法4．底物膜法设计半透膜切片/孵育法★★★影响酶组化实验的关键因素①酶活性的保存a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不同的酶适用不同的固定剂△抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。△慎用醛第3页,共34页，星期六，2024年，5月3b）取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙酮∶氯仿=1∶1）4℃，5～10分钟，但脂溶性蛋白脱落。②底物浓度A）量要足够1∶20V/VB）孵育法只能用一次，配制时要适量（节俭）③PH和渗透压应以缓冲液调节④温度控制与时间：室温37℃（40min）4℃（5～10min）第4页,共34页，星期六，2024年，5月4⑤捕获剂亦要求一定浓度，要以反应原位瞬时沉淀。⑥激活剂与抑制剂（对照）a）两者的选择都应具有