细胞培养及材料细胞毒性检测.ppt

得到细胞1）取材→切割组织块培养法消化培养法2）直接购买→培养（原代培养）传代体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。弃去旧培养液→清洗→加入消化液→吸弃消化液→加入培养液→吹打分散细胞→分装稀释细胞→补加培养液→继续培养第24页,共47页，星期六，2024年，5月接种数量为5×104～8×105个/ml。传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。传代注意事项第25页,共47页，星期六，2024年，5月游离期悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期贴附底物，一般24小时内贴壁。潜伏期此时细胞有生长活动，基本无增殖。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性细胞传代的增殖生长过程第26页,共47页，星期六，2024年，5月细胞观察肉眼观察：培养液的颜色和透明度显微镜观察生长良好的细胞：细胞透明度大，折光性强，轮廓不清生长状态不良的细胞：细胞轮廓增强，细胞折光性变弱；胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质；细胞之间空隙增大；细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落；有时细胞表面及周围出现丝絮状物第27页,共47页，星期六，2024年，5月细胞计数每毫升细胞数血细胞计数板第28页,共47页，星期六，2024年，5月细胞生长的指标细胞生长曲线贴壁率有丝分裂指数(MI)：分裂相数量占全部细胞数量的百分比细胞群体倍增时间四唑盐(MTT)比色法标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入量第29页,共47页，星期六，2024年，5月细胞活力测定细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比台盼蓝法四唑盐(MTT)比色法荧光素双乙酸酯法(FDA)第30页,共47页，星期六，2024年，5月四唑盐（MTT）比色法MTT比色法的原理：活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。第31页,共47页，星期六，2024年，5月细胞培养的其他指标细胞大小：显微测微计法细胞重量：称重法鲜重干重第32页,共47页，星期六，2024年，5月细胞固定与染色细胞固定苏木精-伊红染色Giemsa染色Feulgen染色考马斯蓝染色免疫法细胞核染色：Hoechst、DAPI第33页,共47页，星期六，2024年，5月细胞污染混浊、pH异常改变、细胞外形模糊、漂浮的集落细胞出现增殖缓慢或死亡化学物质的污染非同种细胞污染微生物污染：细菌、真菌、支原体、病毒5.细胞培养的污染和检测第34页,共47页，星期六，2024年，5月细菌污染培养液变黄，出现浑浊镜下可见圆球状颗粒漂浮预防和处理：青霉素、链霉素第35页,共47页，星期六，2024年，5月真菌污染培养液一般不浑浊白色或黄色小点漂浮于培养基表面光镜观察到菌丝预防和处理：抗真菌剂第36页,共47页，星期六，2024年，5月支原体污染可透过滤膜无细胞壁细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。第37页,共47页，星期六，2024年，5月污染的控制预防重新培养鉴别清除：抗生素、加温、支原体特异性血清、共培养法、重新克隆法、动物体内接种除菌法防止交叉污染第38页,共47页，星期六，2024年，5月6.细胞冻存与复苏慢冻快融低温保护剂：10%的甘油或二甲亚砜DMSO细胞深低温保存的基本原理：-80℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。第39页,共47页，星期六，2024年，5月慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产