PCR扩增的原理和操作步骤.pdf

PCR扩增反应的操作

第一节”PCR扩增反应的基本原理

一、娶合晨链具有反应(PCR)的基本购成

PCR是聚合酶链式反应的简称,指在引物指导上由酶催化的对特定模板(克隆或基因织DNA)

的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分了生物

学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。

PCR基本诛理;是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况

下，骨酶进行也补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量

离心管中，加入与待扩增的DNA片段机端已知序列分别互补的商个引物、适量的缓冲液、微昌的

DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、M8g等。反应时先将上述溶液加热，使模板

DNA在高温下变性，双链解开为单链状态:然后降低深液温度，使合成引物在低温下与其靶序询

配对，形成部分双链，称为退火;青将温度升全合适温虚,在TaqDNA聚合香的催化下,以daNTP

为原料，中物沿$一3方铝延伸，夫成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此

重复改变温度，出高录变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使日的某因得以迅

速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成;模板变性、引物退火、热稳定DNA到合蝴在适当温

度下催化DNA链延伸合成《见岁)。

1，模板DNA的变性

模板DNA加热到90-95C时，愉蝶旋结构的所键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变

性，以使它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C半由一个

气键连接，而A-T问只有两个气键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。改

PCR中DNA变性需娄的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量尚低等均有关。

对上高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量`:甲基亚砚CDMSO)，并且在PCR循环中起

始阶段基变性温度可以采用9%记，时间适当延长，即所谓的热启动。

2，懂板DNA与引物的退火

将反应混合物温度降低至37-65C时，宿核匡酸中物与单链模板打交，夫成DNA模板-引物复

合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与孝序列的同源性程度及诊核背酸的碱基组成。一般

村求引物的浓度人人尚于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火

时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之半重新配对成双链的速度要忆得多，退火时间

一般为1一2min。

3.引物的纯伸

DNA模板-4|物复合物在TaqgDNA聚合酶的作用卜，以dNTP为反应原料，刘序列