黄芪中7种黄酮类物质含量的测定高效液相色谱法.docx

黄芪中7种黄酮类物质含量的测定

高效液相色谱法

1范围

本文件规定了黄芩中黄酮类物质的液相色谱测定方法。

本文件适用于液相色谱法测定黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、木犀草素、芹菜素、木犀草素、芹菜素的液相色谱法测定。

本文件的方法检出限：黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的方法检出限均为0.075mg/kg、木犀草素、芹菜素的方法检出限均为0.15mg/kg，千层质素A的的方法检出限为0.10mg/kg。

2规范性引用文件

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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义

本文件没有需要规定的术语和定义。

4原理

试样中的黄酮类物质经70%甲醇超声提取，旋蒸近干，甲醇定容，微孔滤膜过滤，液相色谱仪检测和确证，外标法定量。

5试剂与材料

除非另有规定外，所有试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中规定的一级水。

5.1乙腈（CH3CN）：色谱纯。

5.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。

5.3磷酸（H3PO4）：分析纯。

5.4黄芩苷（Baicalin，CAS号21967-41-9）、木犀草素（Luteolin，CAS号491-70-3）、汉黄芩苷（Wogonoside，CAS号51059-44-0）、黄芩素（Baicalein，CAS号491-67-8）、芹菜素（Apigenin，CAS号520-36-5）、汉黄芩素（Wogonin，CAS号632-85-9）和千层

质素A（OroxylinA，CAS号480-11-5）的液相色谱法测定。

5.5标准溶液配制

5.5.1标准储备溶液：分别准确称取适量的黄芩苷、木犀草素、汉黄芩苷、黄芩素、芹菜素、汉黄芩素和千层质素A（精确至0.01mg），用甲醇溶解，分别配制成1000mg/L的标准储备溶液，-18℃下保存，有效期1年。

5.5.2混合标准中间溶液：根据需要分别取黄酮类物质的标准储备液，用甲醇稀释成10mg/L标准中间溶液，-18℃下保存，有效期3个月。

5.60.1%磷酸溶液（体积分数）：量取1mL磷酸，用水定容至1000mL。

5.7滤膜：0.22μm，有机相。

5.8离心管：50mL，塑料。

6仪器与设备

6.1液相色谱仪：配有紫外检测器。

6.2分析天平：感量0.01g和0.0001g。

6.3高速万能粉碎机：10000r/min。

6.4超声波清洗机。

6.5离心机：4000r/min。

6.6涡旋混合器。

7分析步骤

7.1试样的制备

将试样去除杂质，用高速万能粉碎机粉碎，过45目筛，置于密封袋中备用。

7.2试样的提取

平行做两份试样。称取试样0.2g（精确至0.0001g）于50mL离心管，加入40mL70%甲醇，充分振摇混匀，超声提取30min，放入离心机，4000r/min离心3min，过滤，再取残渣加入40mL70%甲醇，重复提取一次，合并2次滤液，旋蒸后用甲醇定容于50mL容量瓶中，过0.22μm滤膜，待测定。同试样进行空白试验，除不称取样品外，均按试样步骤进行。

7.3液相色谱参考条件

a）色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm（i.d），5μm，或性能相当者；

b）柱温：40℃;

c）流速：0.3mL/min；

d）流动相：A相为0.1%磷酸溶液（5.6），B相为乙腈，梯度洗脱条件见表1；

e）进样量：10.0μL。f）检测波长：280nm。

9精密度

表1流动相及其梯度条件（VA+VB）

时间(min)

流速(mL/min)

VA(%)

VB(%)

0.00

0.8

90

10

15.00

0.8

75

25

25.00

0.8

65

35

45.00

0.8

45

55

53.00

0.8

25

75

60.00

0.8

90

10

65.00

0.8

90

10

7.4标准曲线的绘制

用甲醇将混合标准储备溶液逐级稀释得到浓度为0.5mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L的标准工作液。依次由低到高进行检测，以质量浓度X（mg/L