分子生物学-课件-分子生物第六章.ppt

第六章分子生物学技术;内容;核酸提取与鉴定;第一节核酸提取;核酸提取的主要步骤：;一、质粒DNA;1·培养细菌和扩增质粒;2·收获和裂解细菌;3·分离纯化质粒;（1）氯化铯密度梯度分离法;;(2)碱裂解法（快速提取质粒DNA，收获率高）

;(3)煮沸裂解法;二、真核生物基因组DNA;三、真核生物RNA;提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备;(一)总RNA提取;2、异硫氰酸胍-酚氯仿法;3、氯化锂-尿素法;4·热酚法;(二)mRNA提取;四、核酸纯度鉴定;根据A260/A280，A260/A230的比值判断核酸样品的纯度

1·纯度较高的DNA，A260/A280≈1.8

＞1·8，说明可能含有RNA，或DNA部分降解

＜1·8，说明可能含有苯酚或蛋白质等

2·纯度较高的RNA，A260/A280=1.8-2.0

＜1·8，说明可能含有蛋白质等

＞2·0，说明可能有RNA降解

3·纯度较高的核酸，A260/A230＞2·0

如果比值太小，说明可能含有蛋白质、肽、苯酚或异硫氰酸盐等;第二节核酸电泳;一、琼脂糖凝胶电泳;用途;large;基因组DNA抽提结果电泳图;总RNA抽提结果电泳图;琼脂糖凝胶电泳装置;二、聚丙烯酰胺凝胶电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳检测核酸

非变性电泳聚丙烯酰胺凝胶

用于分离纯化双链DNA片段

变性聚丙烯酰胺凝胶

用于分离和纯化单链DNA片段的。其转载DNA样品量也比琼脂糖凝胶大，分辨力也高于琼脂糖凝胶电泳，相差1bp的DNA片段也能分开，但其操作复杂。;聚丙烯酰胺凝胶制胶装置;第三节DNA测序;一、Sanger双脱氧链终止法;二、Maxam-Gilbert化学降解法;三、DNA测序自动化;思考题;印迹杂交技术;第一节核酸分子杂交;一、变性（denaturation）;DNA变性的本质是氢键的断裂;核酸的变性因素;使双链DNA解链度达到50%所需的温度称为解链温度(Tm)、变性温度、熔点

DNA的解链温度一般在82-95℃，与DNA的分子大小和碱基组成、溶液的pH值和离子强度（+）等有关;二、复性;不是简单的逆变性过程，受多种因素影响:;变性;三、杂交与核酸分子杂交技术;核酸分子杂交技术;;根据杂交体系的不同，核酸分子杂交可以分为：;第二节探针与标记;一、探针种类;;二、探针标记物;;三、探针标记法;(一)切口平移标记法;(二)随机引物标记法;末端标记法;(三)聚合酶链反应标记法

一种标记dNTP和三种普通dNTP为底物，短链探针

(四)末端标记法

T4多核苷酸激酶、末端转移酶、Klenow片段和T4DNA聚合酶;四、探针纯化;第三节固相支持物与印迹;二、印迹方法;第四节常用核酸印迹杂交技术;核酸分子杂交（固相杂交）操作程序;一、DNA印迹法;放射自显影照片;二、RNA印迹法;三、斑点杂交法和狭缝杂交法;斑点杂交和狭缝杂交;四、组织原位杂交(insituhybridization);荧光标记探针检测精子;五、菌落杂交和噬菌斑杂交;六、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH);用两种探针分别和待测DNA杂交，显性纯合子只与正常探针杂交，杂合子与正常和突变探针都杂交，隐性纯合子只与突变探针杂交，因此根据杂交结果可以判断待测个体的基因型

苯丙酮酸尿症患者基因型是隐性纯合子;第五节影响杂交的因素;第六节蛋白质印迹法;一、基本内容;二、注意事项;三种印迹技术的比较;第七节生物芯片;一、基因芯片（genechip）

DNA芯片、DNA微阵列、寡核苷酸微阵列;基因芯片发展历史;(一)基本原理和基本操作;1·芯片制作;2·样品制备

待测样品（Cy3）；对照样品（Cy5）

3.分子杂交

探针含量远多于待测DNA含量（杂交信号强弱与待测DNA含量成正比）

优化杂交条件：离子强度、温度、时间

4、检测分析

以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上DNA探针的原始序列将靶DNA的信息反映出来

;;;大规模基因芯片的应用;(二)应用;二、蛋白质芯片;三、组织芯片;思考题;聚合酶链反应;第一节PCR基本原理;高温变性：94℃左右，目的基因解链为单链，以作为扩增的模板；

低温复性：55～60℃，一对特异性引物分别与模板3’端互补结合；

适温延伸：72℃，延伸反应；

每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，理论上DNA分子可扩增为2n。

;;;;第二节PCR特点;第三节PCR体系组成和反应条件优化;(一)DNA聚合酶;(二)引物;3’;引物设计;(三)dNTP;(四)模板;(五)缓冲溶液;二、条件优化;三、产物分析;第四节常用PCR技术;二、