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多克隆抗体制备流程

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实验方法任你选

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抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的

与抗原有特异性结合能力的一组免疫球蛋白，这种与抗原有特异性结

合能力的免疫球蛋白就是抗体。一般而言，抗体按靶位点不同主要分

为单克隆抗体和多克隆抗体，由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多

种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体，

本篇主要讲述兔源性多克隆抗体制备的相关流程。

抗原有两个基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物质不

一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必须经

过经过一定的改造（偶联蛋白载体BSA，OVA或者HSA等大分子物

质）方能成为完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），

结构越复杂引起免疫反应的能力也就越强。

抗体就是能与特异性抗原结合的免疫球蛋白，抗体一般分为多克

隆抗体和单克隆抗体，多克隆抗体能与抗原的多个表位结合。本篇主

要讲述兔来源的多克隆抗体的生产步骤

多抗一般制备流程：完全抗原的准备→兔子的免疫→效价检测和

终放→抗体亲和纯化→抗体的浓缩和保存。

具体实验步骤如下：

1.兔子的准备

挑选健康的6周大小的新西兰大白兔两只（约2Kg），使其适应

新的生活环境，至少稳定几天再进行首次取血.

预采血（作阴性参照用）

1.1将兔子小心的放入固定的架中,使兔子平静；

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可见(也可不剃)；

1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨胀；

1.4用注射器从耳静脉抽取约10ml血液(约5ml血清)；

1.5小心抽出针头,适当按压伤口以免流血,然后用酒精棉球消毒伤

口；

1.6将收集的血液置于37`C灭活30min,最后置于4`C过夜使其凝

结释放血清；

1.7将凝结好的血液在10000r／min离心10min；h.收集上清，

即为血清。

2.兔子的免疫

2.1注射两只兔子的抗原为1ml,抗原缓冲溶液必须不含对兔子有

害的化学试剂.每只兔子初次免疫400ug抗原比较适合,也可适当减少

以获得更好的结果，后续免疫每次为100ug即可。

2.2将1ml的佛氏完全佐剂与准备好的1ml抗原充分混匀,呈乳白

色；

2.3小心从笼中取出兔子，每只兔子免疫4个部位(背部和大腿根

部均可),每个部位250ul,针头呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留

数秒以防止抗原外流。

2.4免疫周期为20天,免疫完后7-10天取血(包括中途测试取血和

最终放血),总共免疫4-5次。

3.效价检测

3.12个参照:阴性参照为预取血血清，均以1抗起始浓度稀释(封

闭稀释液);阳性参照为以前阳性血清

3.2于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃过夜，也

可以37℃孵育2小时。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封闭液，4℃过夜或者37℃

孵育2小时。

3.4倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体,用洗涤液洗

板三次,每次尽量拍干残留液体,若要放置一段时间,37℃烘干并用封口

袋封好于-20℃存放。

3.5取包被好的96孔板，第一孔加入阴性参照液100ul，第二孔

加入阳性参照液100ul，第三孔加入1:500的待测抗血清，后续各孔在

此基础上倍比稀释，于37℃孵育1小时。

3.6倒掉液体，用洗涤液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP

标记的小鼠抗兔IgG（1：2000稀释