WB原理及操作注意事项讲课文档.pptVIP

第1页，共34页。印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法（Westernbloting），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

第2页，共34页。原理免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Westernblotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS的高分辨力和固相免疫测定高特异性和敏感性，现已成为蛋白质分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对某种蛋白进行定性和半定量分析。第3页，共34页。特点1.SDS的高分辨力2.固相免疫测定高特异性和敏感性第4页，共34页。第5页，共34页。常见问题和注意事项一.蛋白处理与样品处理二.蛋白质转印三.免疫杂交四.信号检测第6页，共34页。一、蛋白处理与样品处理1.如何选择裂解液？2.目标蛋白含量低怎么办？第7页，共34页。1.如何选择裂解液变性裂解液：快速，含有离子型去垢剂，作用强，可迅速从组织和细胞中提取大量蛋白质eg：2*SDS上样缓冲液非变性裂解液：较温和，适用于识别非变性的抗原表位的抗体，可配合免疫沉淀、活性分析等应用eg：RIPAbuffer（含TritonX-100，提全细胞蛋白）TotalproteinExtractionKit(含NP-40，更温和)WholeCellExtractionKit(最温和，可做酶活性分析)NuclearExtractionKit(用来提取核蛋白)第8页，共34页。2.目标蛋白表达量低加大上样体积浓缩样品超滤离心，快速、高效，且可以起到一定的提纯效果，去除一些小分子蛋白增大胶厚度第9页，共34页。二、蛋白质转印1.转印不完全2.小分子蛋白的穿流3.免疫检测前如何判断转移效果4.操作规范第10页，共34页。1.转印不完全要选对膜！常用的膜有两种：PVDF：聚偏二氟乙烯NC：硝酸纤维素第11页，共34页。第12页，共34页。优化转移过程调节转移缓冲液成分：SDS（0.05%）甲醇（10%-20%小分子除外）延长凝胶在转移缓冲液中平衡时间（去除凝胶中的SDS）5-30min第13页，共34页。InSDSsystems,therunningbufferissupplementedwithSDS.ThisSDSconcentratesfromthecathodereservoirandrunsintothegelbehindthebromophenolbluetrackingdye.Sincemostgelsarerununtilthetrackingdyeisatthebottomofthegel,alloftheexcessSDSremainsinthegelandiscarriedoverintotheblottingprocedure.Ifitisn’tallowedtodiffuseoutofthegelpriortotransfer,itwillinterferewithproteinadsorption.Equilibrationtimescanbeextendedupto30minutes,andsufficientbuffershouldbeusedtoreducetheSDStoaminimallevel.第14页，共34页。第15页，共34页。Inthisstudy,radioactiveBSAwasresolvedbySDS,andthegelswereequilibratedintransferbufferforperiodsrangingfrom0to30minu