免疫学检测和免疫学技术专家讲座.pptVIP

免疫学检测与免疫学技术一、抗原抗体检测技术二、免疫细胞检测三、细胞因子检测四、免疫相关基因分析五、免疫标识技术六、免疫PCR(IM-PCR)技术七、杂交瘤技术与T细胞克隆技术八、新型抗体制备技术九、抗原制备技术免疫学检测和免疫学技术第1页

一、概述免疫学检测是应用免疫学理论设计一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌细胞因子试验伎俩及分子生物学技术在免疫学研究中应用。?

免疫学技术应用极为广泛,疾病诊疗、疗效评价及理论研究等。二、抗原抗体检测技术*依据反应基本原理与表现主要分为凝集反应、沉淀反应和补体参加各种反应*依据抗原抗体反应设计试验还有标识抗原(或抗体)检测对应物质标识技术。免疫学检测和免疫学技术第2页

对机体参加免疫应答细胞进行判定,计数及功效测定(一)细胞计数1.荧光抗体染色2.免疫酶染色技术:*ABC法*APAAP法3.免疫金银染色法(IGSS)4.免疫细胞化学法5.四聚体法6.TCR?链测定三、免疫细胞检测免疫学检测和免疫学技术第3页

(二)免疫细胞功效测定1.T细胞功效测定：肿瘤，病毒感染，免疫缺点，本身免疫病等(1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有PHA.ConA和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等；*同种MHC及抗CD3单抗等*肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养(2)T细胞介导细胞毒试验：CTL(3)分泌功效检测(4)T细胞功效体内检测法*接触性超敏反应*移植物抗宿主反应(GVHR)*迟发型超敏反应(DTH)免疫学检测和免疫学技术第4页

2.B细胞功效判定(1)B细胞增殖(转化)试验:*PWM、SAC，LPS（对小鼠B细胞）；*抗IgM抗体及EB病毒等(2)溶血空斑形成试验(3)反向溶血空斑试验(4)酶联免疫斑点法(ELISPOT):ELISPOT是一个可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量体外试验方法。*此法主要优点是:①?稳定、特异，且抗原用量少；②可同时检测不一样抗原诱导抗体分泌，并可定量测定；③可检测组织切片中分泌抗体单个细胞。免疫学检测和免疫学技术第5页

3.NK细胞活性测定体外检测NK细胞活性方法有形态学检验法，放射性核素释放法，酶释放法，化学发光法及流式细胞术等。测定人NK细胞活性常以K562细胞株作为靶细胞，测定小鼠NK细胞活性惯用YAC－1细胞为靶细胞。(1)形态学检验法(2)放射性核素释放法:用放射性核素(51Cr、125I－UdR)标识靶细胞。(3)酶释放法:测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中乳酸脱氢酶(LDH)活性。*NAG酶荧光比色法:NAG酶是细胞浆中存在一个溶酶体酶,与其底物作用后,生成荧光产物,应用荧光分光光度计测定，敏感性显著高于LDH比色法。而且方法简单，结果稳定，重复性好。免疫学检测和免疫学技术第6页

(4)化学发光法(5)流式细胞术:应用FCM检测NK细胞活性是依据PI染料排斥法。PI渗透死亡细胞内与DNA和RNA结合，在488nm波长激发下产生绿色荧光。此法既能够测定单个细胞毒活性，也能够用于总细胞毒活性试验。*还可利用荧光染料法,细胞光扫描法，双标识细胞毒法测定细胞毒性细胞杀伤效应。免疫学检测和免疫学技术第7页

4．吞噬细胞功效测定(1)中性粒细胞趋化功效测定:普通采取滤膜渗透法(Boyden小室法)或琼脂糖平板法。(2)中性粒细胞吞噬、杀菌功效测定1)显微镜检法2)NBT试验:此项试验是测定中性粒细胞吞噬、杀菌功效一个简易方法。3)化学发光测定法:中性粒细胞在吞噬过程中出现呼吸暴发,产生活性氧代谢产物。这类活性氧化基团与细胞内杀菌作用亲密相关，同时又能激发细胞内一些物质产生化学发光。免疫学检测和免疫学技术第8页

(4)巨噬细胞细胞毒测定:通常取小鼠腹腔巨噬细胞，以?-干扰素为激活剂使其活化，作为效应细胞。用125I-UdR标识DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815作为靶细胞。(3)巨噬细胞吞噬功效测定:中药斑蝥酒精浸液敷贴法诱发无菌性皮炎，从皮肤水泡渗出液中搜集巨噬细胞，在体外进行鸡红细胞吞噬试验，计算吞噬率和吞噬指数，作为判断巨噬细胞吞噬功效指标。免疫学检测和免疫学技术第9页

四、细胞因子检测（一）免疫学检测法免疫学检测基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法