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枣中环磷酸腺苷的测定高效液相色谱法

1范围

本文件规定了枣中环磷酸腺苷的高效液相色谱测定方法。

本文件适用于枣中环磷酸腺苷的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

环磷酸腺苷(cyclicadenosine-3，5-monophosphate，简称cAMP)是核苷酸衍生物，具有第二信使的作用，是有机体中广泛存在的一种具有生理活性的重要物质。

4原理

试样用甲醇/磷酸二氢钾溶液超声提取，高速离心后，用高效液相色谱-紫外检测和确证，以保留时间定性，面积外标法定量。

5试剂

除非另有规定外，所有试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中规定的一级水。

5.1甲醇（CH4O）：色谱纯。

5.2磷酸二氢钾（KH2PO4）：分析纯。

5.30.05mol/L磷酸二氢钾溶液：准确称取6.80g磷酸二氢钾，用水溶解并定容至1000mL容量瓶中，混匀后过膜使用。

5.4甲醇/0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（2:8=v:v），取20mL甲醇加入80mL0.05mol/L磷酸二氢钾溶液中混匀。

5.5甲醇/水溶液（7:3=v:v）：取30mL水加入70mL甲醇中混匀。

5.6标准品：环磷酸腺苷（cAMP），CAS号60-92-4，纯度≥99%。

5.7标准溶液配制：准确称取环磷酸腺苷标准品10mg（精确至0.01mg），用甲醇水溶液

（5.6）溶解并定容至10mL容量瓶中，即为1000mg/L的标准溶液，于-18℃贮存。

6仪器与设备

6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器（UV）。

6.2分析天平：感量0.01g和0.00001g。

6.3组织捣碎机。

6.4高速万能粉碎机：10000r/min。

6.5超声波清洗器。

6.6离心机：4000r/min。

6.7涡旋混合器。

6.8离心管：50mL，塑料。

6.9滤膜：0.22μm，水相。

7试样的制备及提取

7.1试样的制备

鲜枣去核后，经高速匀浆机处理，置于样品盒中，-18℃冷冻备用。

干枣去核后，经烘箱烘干，用高速万能粉碎机粉碎，置于样品袋中，-18℃冷冻备用。

7.2试样的提取

干枣样品：称取1g（精确到0.001g）制备好的试样于50mL离心管中，加入20.00mL提取液（5.5），涡旋1min后，放置超声波中超声提取40min（期间振摇2-3次），取出后在4000r/min转速下离心10min，取上清液，过0.22μm水相滤膜，用高效液相色谱-紫外测定。

鲜枣样品：称取5g（精确到0.01g）制备好的试样于50mL离心管中，其余步骤同上。

8液相色谱参考条件

8.1色谱柱：C18色谱柱，250mm×4.6mm（i.d），5.0μm，或性能相当者；

8.2柱温：35℃;

8.3流动相：甲醇，0.05mol/L磷酸二氢钾溶液；

8.4流速：0.8mL/min；

8.5进样量：10μL；

8.6波长：254nm；

8.7等度洗脱：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液=15:85。

9标准曲线的绘制

将标准溶液分别配制成1.0mg/L、5.0mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L，依次由低到高进样检测，以质量浓度X(mg/L)为横坐标，响应值（峰面积）Y为纵坐标进行线性回归，得到环磷酸腺苷的标准曲线回归方程。

10测定

待测液中环磷酸腺苷的响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。同时做空白试验。

11结果计算

样品中环磷酸腺苷的含量按公式（1）计算。

w=ρV （1）

式中：

w———待测液中环磷酸腺苷含量，单位为mg/kg；

ρ0环磷酸腺苷标准溶液的质量浓度，单位为mg/L；

A0环磷酸腺苷标准溶液的峰面积；

A———样液的峰面积；

V———提取体积，单位为mL；

m———试样质量，单位为g；

测定结果取两次测定的算术平均值，计算结果保留两位有效数字。

12色谱图

环磷酸腺苷标准溶液色谱图见附录A。

13精密度

在重复性条件下，