分子生物学第九章核酸的提取与鉴定.pptx

第九章

核酸的提取与鉴定;第一节核酸提取;;核酸提取的基本步骤

⒈破碎细胞；

⒉除去其他生物分子；

⒊分离核酸；

⒋除去杂质；

⒌鉴定和储存

;一、质粒DNA的提取;质粒DNA提取的基本步骤：

⒈培养细菌和扩增质粒

⒉收获细菌和溶菌

⒊提取质粒;⒈培养细菌和扩增质粒;⒉收获细菌和溶菌;溶菌：破坏细胞壁和细胞膜;10;⒊提取质粒:去除染色体DNA;提取方法：;氯化铯密度梯度离心;溴化乙锭（EB）：降低线形DNA的密度;⑵碱裂解法;⑶煮沸裂解法;二、真核生物基因组DNA;组织DNA的提取（SDS/酚法）;组织DNA的提取过程(4℃/灭菌器皿);三、真核生物RNA;21;匀浆组织

4℃/细胞裂解液（异硫氰酸胍、巯基乙醇、SDS等）;㈡mRNA的提取;四、核酸纯度鉴定;核酸纯度测定：

DNA样品：OD260/OD280≈1.8

RNA样品：OD260/OD280≈1.8-2.0;第二节核酸凝胶电泳;双链DNA的电泳

负极到正极：分子量由大到小;根据支持物分为：

一、琼脂糖凝胶电泳

二、聚丙烯酰胺凝胶电泳;电泳槽（垂直和水平）;一、琼脂糖凝胶电泳;操作：

⒈选择琼脂糖种类、确定浓度(根据核酸分大小)；

;琼脂糖凝胶浓度(%);⑴加缓冲液;⑶灌胶，插入梳子（冷却40-45度后凝固）；

⑷将凝胶置于电泳槽中；

⑸加入电泳缓冲液，拔出梳子;操作流程大致为：

凝胶的制备→胶板的制备→加样→电泳

→观察和拍照。;上样缓冲液的作用

（监测电泳的进程；增加样品密度）;⒌染色：

溴化乙锭：一种荧光染料，

和双链DNA结

合后，在紫外

光照射下发橙

黄色荧光；

;⒍检测：紫外透射仪、凝胶呈像分析系统;凝胶电泳的应用

⒈核酸分子量的检测;⒉鉴别分子量相同而构型不同的DNA分子;⒊RNA样品质量的检测;;聚丙烯酰胺凝胶电泳分类

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离单链DNA）

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离双链DNA）;第三节DNA测序;DNA一级结构的测定在过去是很困难的时代是很困难的工作，因为DNA分子太巨大了。1975年Sanger发明的DNA???序加减法为实现序列测定起了关键性的作用。由此而发展起来的大片段DNA顺序快速测定技术──Maxam和Gilbert的化学降解法(1977年)和Sanger的末端终止法(1977年)，已是核酸结构与功能研究中不可缺少的分析手段，一些先进的自动测序仪器也已问世。

;Sanger双脱氧测序由英国剑桥大学分子生物学实验室的F.Sanger等人于1977年发明了利用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法。;这种方法利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催反应的特性：第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA作模板，合成出准确的DNA互补链；第二，DNA聚合酶能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，将其掺入到寡核苷酸链的3’-末端，从而终止DNA链的生长。;;DNA化学修饰法是由美国哈佛大学的A.M.Maxam和W.Gilbert发明的,所以又叫作Maxam---GilbertDNA序列分析法。;;Maxam—Glibert化学修饰法;⒉读序;三、DNA测序自动化;目前所用测序技术的缺点;高通量测序技术(High-throughputsequencing)

;高通量测序流程;现有主要高通量测序仪开发商;高通量测序应用范围;测序技术目标