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猫细小病毒PCR检测方法

1范围

本标准规定了猫细小病毒PCR（polymerasechainreaction）的实验条件、操作步骤、结果判定。本标准适用于猫细小病毒（猫泛白细胞减少症病毒）的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

猫细小病毒Felinepanleukopeniavirus，FPLV

属细小病毒科，细小病毒亚科，牛犬细小病毒属成员，又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性胃肠炎病毒或猫瘟病毒。

4实验条件

4.1试剂

4.1.1要求

除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为符合GB/T6682要求的灭菌双蒸水或超纯水。

4.1.2试剂

4.1.2.1核糖核酸酶（20mg/mL）。

4.1.2.210%十二烷基磺酸钠溶液。

4.1.2.310mg/mL蛋白酶K。

4.1.2.4Tris-盐酸饱和酚（pH7.6）。

4.1.2.5酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1）：在一灭菌棕色瓶中按25：24：1比例分别加入酚、氯仿、异戊醇。

4.1.2.63mol/L乙酸钠（pH5.4）。

4.1.2.7琼脂糖。

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4.1.2.810μg/μL溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）：溴化乙锭20mg、加灭菌双蒸水至20mL充

分溶解混匀而成。

4.1.2.950×TAE缓冲液：羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g、冰乙酸57.1mL、0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL，加灭菌双蒸水至1000mL充分混匀。

4.1.2.10加样缓冲液：聚蔗糖25g、溴酚蓝0.1g、二甲苯青0.1g，加灭菌双蒸水至100mL充分溶解混匀而成。

4.1.2.112.5mmoldNTPs（deoxyribonucleosidetriphosphates，脱氧核糖核苷三磷酸）。

4.1.2.1210×PCRBuffer。

4.1.2.13DNA分子量标准：DL2000。

4.1.2.14引物序列FPLV-F：5—CCAGCTGAGGTTGGTTATAGTG—3；FPLV-R：5—GGTGCATTTACATGAAGTCTT

GG—3。

4.2仪器设备

4.2.1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000根rpm以上。

4.2.2PCR扩增仪。

4.2.3核酸电泳仪和水平电泳槽。

4.2.4微波炉。

4.2.5分析天平。

4.2.6恒温水浴锅。

4.2.7冷藏冰箱和低温冷冻冰箱。

4.2.8微量移液器。

4.2.9凝胶成像系统（或紫外透射仪）。

4.2.10高压灭菌锅。

4.2.11超净工作台或生物安全柜。

5操作步骤

5.1样品的采集和处理

5.1.1采集动物粪便、肛拭子、全血或肠道等组织样品并进行处理:

a)肛拭子、粪便（加适量PBS）等样品经4℃5000rpm/min离心2min，取上清液；b)全血样品待血凝后经5000rpm/min离心2min，取血清；

c)取0.1g肠道等样品与灭菌PBS（全称、浓度）按1：5的重量体积比制成悬液，匀浆后，反复冻融3次，在涡旋混合器上混匀后经4℃5000rpm/min离心10min，取上清液。

5.1.2制备的样品在2℃~8℃保存时间不应超过24h，长期保存应分装成小管，置于-20℃以下，避免反复冻融。

5.2DNA的提取

5.2.1设立阳性、阴性样品对照，阳性对照为猫细小病毒阳性样品，阴性对照为灭菌双蒸水。

5.2.2按下列步骤完成DNA的提取，也可选择市售商品化DNA提取试剂盒，完成DNA的提取：

a)取1.5mL灭菌离心管，加入处理样品5.1.1上清液400μL和30μL（20mg/mL）核糖核酸酶，混匀后，室温下作用20min；

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b)加入43μL10%的十二烷基磺酸钠溶液和5μL蛋白酶K，42