新克隆技术不用酶切位点直接克隆.pptx

In-Fusion

克隆技术简介December30,2023宝日医生物技术（北京）有限企业

主要内容12/30/202321In-Fusion?技术原理3In-Fusion?应用实例4In-Fusion?应用文件2In-Fusion?试验措施

In-Fusion?技术原理示意图12/30/20233In-Fusion酶Clontech专利50℃，15min单管反应

In-Fusion?技术特点12/30/20234开放性无缝克隆多片段克隆In-Fusion不受载体限制不受酶切位点限制不附加任何冗余序列一次反应单管操作阳性率高达80%

主要内容12/30/202351In-Fusion?技术原理3In-Fusion?应用实例4In-Fusion?应用文件2In-Fusion?试验措施

试验措施12/30/20236引物设计PCR扩增片段和载体酶切处理连接体系建立引物设计PCR扩增载体线性化连接体系建立老式基因克隆操作流程In-Fusion基因克隆操作流程

引物设计12/30/20237一般PCR引物In-FusionPCR引物保护碱基序列完整旳酶切位点与目旳基因片段相同/相互补旳特异碱基序列15bp同源碱基序列补齐酶切位点缺失碱基与目旳基因片段相同/相互补旳特异碱基序列5′--3′-3′5′-

In-Fusion?引物设计原则12/30/20238平末端和黏性末端均可直接进行in-fusion连接选择与载体末端相同的15bp同源碱基序列补齐酶切位点缺失碱基同源序列部分是与线性化载体末端5’end前15bp相互补旳碱基序列无需进行末端补平或者去磷酸化处理若保存酶切位点，需补齐酶切位点缺失碱基

In-Fusion?引物设计原则12/30/20239平末端和黏性末端均可直接进行in-fusion连接无需进行末端补平或者去磷酸化处理

In-Fusion?引物设计---原则112/30/202310黏性末端（5’悬挂）黏性末端（3’悬挂）平末端

In-Fusion?引物设计原则12/30/202311选择与载体末端相同的15bp同源碱基序列同源序列部分是与线性化载体末端5’end前15bp相互补旳碱基序列

In-Fusion?引物设计---原则212/30/202312黏性末端（5’悬挂）黏性末端（3’悬挂）平末端

In-Fusion?引物设计原则12/30/202313补齐酶切位点缺失碱基若保存酶切位点，需补齐酶切位点缺失碱基

In-Fusion?引物设计---原则312/30/202314补齐酶切位点部分缺失碱基

In-Fusion?引物设计在线工具12/30/202315在线工具网址/CN/Support/Online_Tools片段与载体用量计算工具PCR引物转换工具

载体线性化12/30/202316PCR扩增酶切处理

建立In-Fusion?连接体系12/30/202317RxnComponentCloningRxn5XIn-FusionHDEnzymePremix2μlLinearizedVectorxμl*PurifiedPCRFragmentxμl**dH2OxμlTotalVolume10μlLinearizedvector:PurifiedPCRfragment(摩尔比)=1:2*0.5kb:10-50ng,0.5to10kb:50-100ng,10kb:50-200ng**10kb:50-100ng,10kb:50-200ng

主要内容12/30/2023183In-Fusion?应用实例1In-Fusion?技术原理4In-Fusion?应用文件2In-Fusion?试验措施

In-Fusion?应用12/30/202319应用多片段克隆插入突变构建载体模型高通量克隆

In-Fusion?应用实例12/30/2023201多片段克隆实验2插入突变实验In-FusionTMassembly:seamlessengineeringofmultidomainfusionproteins,modularvectors,andmuta