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⽣⽣物物化化学学实实验验课课件件讲讲解解

实验⼀⼆硝基⽔杨酸⽐⾊法测定总糖含量

（4学时）

⼀、实验⽬

（1）掌握⼆硝基⽔杨酸⽐⾊法测定总糖原理。

（2）学习分光光度计使⽤⽅法。

（3）掌握⽐⾊定糖法操作技术。

⼆、实验原理

在碱性条件下，还原糖与3，5-⼆硝基⽔杨酸共热，3，5-⼆硝基⽔杨酸被还原为3-氨基-5硝基⽔杨酸（棕红⾊物质），还原糖

则被氧化成糖酸及其他产物，在⼀定范围内，还原糖量与棕红⾊物质颜⾊深浅程度成⼀定⽐例关系，在540nm波长下测

定棕红⾊物质吸光度，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖含量。总糖可在强酸条件下⽔解，得到还原糖，

从⽽间接求出样品中总糖含量。

三、实验仪器

（1）刻度试管：25mL；

（2）烧杯：100mL；

（3）三⾓瓶：100mL；

（4）容量瓶：100mL；

（5）刻度吸管：1mL，2mL，10mL；

（6）恒温⽔浴；

（7）沸⽔浴；

（8）离⼼机（过滤法不⽤此设备），离⼼管或玻璃漏⽃，电⼦天平，分光光度计。

四、实验试剂

（1）1mg/mL葡萄糖标准液：准确称取0.250g分析纯葡萄糖（预先80℃烘⾄恒重），置于⼩烧杯中，⽤少量蒸馏⽔溶解后，

定量转移到250mL容量瓶中，以蒸馏⽔定容⾄刻度，摇匀，冰箱中保存备⽤。

（2）3，5-⼆硝基⽔杨酸试剂：将6.3g3，5-⼆硝基⽔杨酸和262mL2mol/LNaOH溶液，加到500mL含有185g酒⽯酸钾

钠热⽔溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏⽔定容⾄1000mL，贮于棕⾊瓶中备⽤。

（3）碘-碘化钾溶液：称取5.0g碘、10.0g碘化钾，⽤蒸馏⽔溶解⾄100mL。

（4）酚酞指⽰剂：称取0.1g酚酞溶于70%⼄醇⾄250mL。

（5）6mol/LHCl，6mol/LNaOH。

（6）⼩麦淀粉，⾷⽤⾯粉。

五、实验操作

1．制作葡萄糖标准曲线

取7⽀刻度试管，按下表操作。

管号0123456葡萄糖标准液/mL00.20.40.60.81.01.2蒸馏⽔/mL2.01.81.61.41.210.83，5-⼆硝基⽔杨酸/mL1.51.5

1.51.51.51.51.5将各管内液体混匀，在100℃⽔浴中加热5min，取出冷却⾄27~30℃后以蒸馏⽔定容⾄25mL，将各管摇

匀，将分光光度计调⾄540nm波长，⽤零号管调零，再读取1~6号管吸光度，然后将读取吸光度为纵坐标，葡萄糖mg数

为横坐标，绘制出标准曲线。2．还原糖及总糖待测液制备

（1）还原糖待测液制备：取3.0g⼩麦淀粉，置于100mL三⾓瓶内，缓缓加⼊50mL蒸馏⽔，边注⽔边搅拌，直⾄均匀溶

解，将溶液置于于50℃恒温⽔浴加热20min，离⼼机过滤5min，⽤20mL蒸馏⽔清洗残液，再⽤离⼼机过滤，然后将2次上

清液集中于100mL容量瓶中，蒸馏⽔定容⾄刻度，混匀，作为还原糖待测液。

（2）样品中总糖⽔解和提取：准确称取1.0g⾷⽤⾯粉，放在100mL三⾓瓶中，加⼊10mL6mol/LHCl及15mL蒸馏

⽔，置于沸⽔浴中加热⽔解30min，取1~2滴⽔解液于⽩瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查⽔解是否完全，如已经⽔解完

全，则不显蓝⾊。待三⾓瓶中⽔解液冷却后，加⼊1滴酚酞指⽰剂，以6mol/LNaOH中和⾄微红⾊，过滤，再⽤少量蒸馏

⽔冲洗三⾓瓶及滤纸，将滤液全部收集在100mL容量瓶中，以蒸馏⽔定容⾄刻度，混匀。精确取10mL定容过⽔解液，

移⼊另⼀个100mL容量瓶，以⽔稀释定容，作为总糖待测液。

（3）显⾊和⽐⾊，取4⽀25mL刻度试管，编号，按下表所⽰量操作。

管号

还原糖测定管号总糖测定管号①②ⅠⅡ还原糖待测液/mL2200总糖待测液/mL0011蒸馏⽔/mL

00113,5-⼆硝基⽔杨酸/mL

1.5

1.5

1.5

1.5

将各管内液体混匀，在沸⽔浴中加热5min，取出冷却⾄36℃，蒸馏⽔定容⾄25mL。将分光光度计调⾄540nm波长，以葡

萄糖零号管调零，在分虽读取①、②、Ⅰ、Ⅱ4个管吸光度。

3．还原糖及总糖测定

以管①、②吸光度平均值和管Ⅰ、Ⅱ吸光度平均值，分别是在标准曲线上查出相应还原糖毫克