生物化学第十四章 基因重组和基因工程.pptx

GeneticRecombinationandGeneticEngineering;第一节自然界DNA重组和基因转移;接合作用(conjugation);（一）接合作用;5;质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子;可接合质粒如F因子(Ffactor);（二）转化作用;例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。;10;（三）转导作用;λ噬菌体的生活史;13;（四）、转座;插入序列(insertionsequences,IS)组成：

二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列

特有的正向重复序列

一个转座酶（transposase)编码基因;插入序列的复制性转座;转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列

转座酶编码基因

抗生素抗性等有用的基因;由转座子介导的转座;在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。;一、同源重组(homologousrecombination)

发生在同源序列间的重组称为同源重组，

又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。;;以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。;Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤;片段重组体（见模型图左边产物）：

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。;;;;;基因工程的

原理;重组DNA技术的发展史;第二节

重组DNA技术;一、重组DNA技术相关概念;(1)分子克隆(molecularclone),即DNA克隆

(2)细胞克隆；

(3)个体克隆（动物或植物）。;DNA克隆

应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。;1.目的基因的获取

2.克隆载体的选择与构建

3.外源基因与载体的连接

4.重组DNA导入受体菌

5.重组体的筛选

6.克隆基因的表达;基因工程的工具酶;限制性核酸内切酶-----“分子手术刀”

;作???

与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。;细菌的限制性核酸内切酶;噬菌体入侵;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；

第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；

第四个字母代表株；

用罗马数字表示发现的先后次序。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；

第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；

第四个字母代表株；

用罗马数字表示发现的先后次序。;分类

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

（基因工程技术中常用Ⅱ型）;Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome);;被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。;EnzymesinvolvedinDNAcloning

Restrictionendonucleases(II)

;同功异源酶

来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;同尾酶

有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。;重组DNA技术中常用的工具酶;1、目的基因;1.化学合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。

2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)

3.cDNA文库(cDNAlibrary)

4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

;*化学合成法获取目的基因;分子文库;55;变性、退火、延伸三步曲;2、克隆载体的选择与构建;（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制

（2）具有合适的限制性酶切位点（多克隆位点，外源DNA插入点）

（3）具有合适的筛选标记

（4）细胞内拷贝数要多

（5）载体的分子量要小，以容纳较大的外源DNA。

（6）细胞内稳定性高

;;质粒载体

的一般结构;λ噬菌体DNA改造系统

λgt系列（插